大肠杆菌、菌落总数检测步骤
食品中菌落总数和大肠菌群的检测
最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释倍数
4、 < 30
最低稀释菌度平均落数 X 最低稀释倍数
5、 > 300 或 < 30
取最接近的 X 稀释倍数
6、 无法计数
报告无法计数
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稀释度选择及细菌总数报告方法（表7）
平均 菌落
稀释
稀释液及菌落数
数 倍数 10-1
例次
10-2 10-3
细菌总数
(个/g或个/ml)
注意：是并不是所有食品都规定细菌指标，如酸乳、酸泡 菜等。
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• 因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜 度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用， 但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生 质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检 验，才能作出比较全面、准确的评价。
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一、菌落总数测定法
菌落总数（ aerobic plate count）
2.若有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30～300个菌落）时， 按如下公式计算：
•
N= ∑C/(n1 +0.1n2)d
• 式中：
• N — 样品中菌落数；
• ∑C — 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
• n1 — 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； • n2 — 适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； • பைடு நூலகம் — 稀释因子（第一稀释度）；
6
• 另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀 释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直 接计数，这样计数的结果，既包括活菌， 也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细 菌总数。
• 目前我国食品卫生标准中规定的细菌总 数实际上是指菌落总数。即指的是在平板 计数培养基上长出的菌落数。
大肠杆菌菌落总数检测步骤
大肠杆菌菌落总数检测步骤大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在环境卫生、食品安全等领域中具有重要意义。
因此，对大肠杆菌和细菌总数的检测非常重要，以下是大肠杆菌和菌落总数检测的详细步骤：1.试样采集：首先，需要进行试样采集。
根据实际需要，可以使用不同的方法采集试样，如直接采集水样、食品样品或其他样品，或者通过培养基进行采样。
试样采集应注意保持无菌环境，并避免样品污染。
2.试样预处理：试样采集后，需要进行预处理。
根据试样的不同特点，可以选择不同的预处理方法。
例如，对于食品样品，可以使用加热、超声波或化学处理等方法，以杀灭或抑制其他细菌的生长，保留大肠杆菌。
3.分离培养：预处理后的试样需要进行分离培养。
将试样分离到含有LB（Luria-Bertani）培养基或EC（Escherichia coli）培养基等富含葡萄糖和其他营养物质的培养基中。
将培养基倒入含有试样的培养皿中，并进行搅拌均匀。
然后，将培养皿盖好，使用适当的培养条件，如37℃温度和24小时培养时间，培养大肠杆菌。
4.鉴定大肠杆菌：在培养后，可以使用不同的方法鉴定大肠杆菌。
例如，可以通过形态学特征，如菌落形状、大小、颜色等，进行初步的鉴定。
然后，可以进一步进行生理和生化试验。
比如，可以使用氧化酚红在培养基中进行试验，观察菌落颜色变化，进行鉴定。
此外，还可以使用PCR方法进行分子鉴定，通过特定的引物和扩增反应，鉴定大肠杆菌的DNA序列。
5.菌落总数检测：除了检测大肠杆菌，还需要检测样品中的菌落总数。
菌落总数是指一定体积的试样中所有菌落的数量。
菌落总数可以用于评估样品的卫生状况和细菌污染程度。
检测菌落总数的方法包括传统的平板计数法和现代的膜过滤法。
6.平板计数法：平板计数法是最常用的菌落总数检测方法之一、方法是将试样平均分布在含有琼脂的培养皿中，然后在恰当的条件下培养细菌。
培养后，可以使用计数板或显微镜对菌落进行计数。
最后，根据计数结果和稀释倍数，计算出菌落总数。
大肠杆菌检测
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
菌落总数大肠菌群检验范例
饼干中菌落总数与大肠菌群的测定GB/T4789.24 食品卫生微生物学检验糖果，糕点，蜜饯检验一、检测对象散装饼干，小包装饼干二.仪器用具1仪器高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2℃-5℃ ）、电子天平、电炉等。
2用具无菌吸量管（1mL）、放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、灭菌试管平皿(直径9cm)、刻度吸管、采样瓶、小倒管等。
三．食品的采样方法采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。
1.即食类预包装食品取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染。
2. 散装食品或现场制作食品根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。
3. 采集样品的标记应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。
4.5 采集样品的贮存和运输采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。
运输时应保持样品完整。
如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。
四．菌落总数的测定1.菌落总数aerobic plate count：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
2. GB 4789.2－2010 菌落总数测定流程检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质↓10 倍系列稀释↓选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内，每皿中加入15 mL～20 mL平板计数琼脂，混匀↓36 ℃±1 ℃，48 h± 2 h培养，计数各平板菌落数↓报告2.菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：N = ΣC / [n1 + (0.1×n2) ] ×(d)N = 样品中菌落数ΣC =平板菌落数之和n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数n2 =含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数d = 第一稀释度（低）3. 平板计数琼脂培养基成分A胰蛋白胨 5.0gB 酵母浸膏 2.5 gC 葡萄糖 1.0 gD 琼脂 15.0 gE 蒸馏水 1000 mLpH 7.0 +/- 0.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH.分装试管或锥形瓶，经121℃高压灭菌15min.五．大肠菌群的测定1.GB 4789.3－2010大肠菌群计数a.检样25 g+225 mL稀释液b.适当十倍稀释样品c.选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST 肉汤（每管9 mL LST肉汤并加有导管），每管接种1 mLd.36℃，24 ± 2 h ~48 ± 2 he.没有产气管有产气管,报告阴性有产气管,接种BGLB肉汤管,36 ±℃，48 ±2h,查MPN表报告结果（大肠菌群）.有产气管,接种EC肉汤,44.5±0.5 ℃（水浴培养）,24 ± 2 h ~48 ±2 h.产气管接种EMB平板（36℃、18~24 h）.从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气,查MPN表报告结果（大肠杆菌）2．培养基Ⅰ .LST成份胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g乳糖 5.0 g氯化钠 5 .0g磷酸氢二钾 2.75g磷酸二氢钾 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000 mLpH 6.8 +/- 0.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH.分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。
ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
大肠杆菌及菌落总数
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
)实验器材(三 (1) 菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏3.0 g 蛋白胨10.0g NaCl 5.0g 水1000mL pH7.4～7.6 将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。
也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达7.6。
反之，用1mol/LHCL 进行调节。
无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是0.9%：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
2)器材试剂：牛肉膏蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水牛角匙试管培养皿三角烧瓶带玻璃塞瓶天平高压蒸气灭菌锅牛皮纸麻绳 pH5.5-9.0试纸（）棉花记号笔纱布吸管pH 灭菌平皿灭菌的具塞三角瓶量筒玻璃棒电热炉称量杯灭菌三角瓶灭菌试管灭菌吸管．高压蒸气灭菌：1.将内层锅去处，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。
细菌总数和大肠杆菌的测定
高温之所以能杀死微生物，主要是因为微生物细胞的基本组成是蛋白质，蛋白质遇热会凝固变性。
而启动一切生命活动的生物催化剂-酶，其主要成分也是蛋白质，也具有不耐热性。
湿热比干热容易杀死微生物，原因是蛋白质的含水量越多，加热时愈容易凝固，而且湿热所用的水蒸气的传导力与穿透力都比较强，更容易破坏蛋白质。
微生物在其最低生长温度下代谢活动减弱，处于休眠状态，维持生命而不发育。
实验室常用冰箱保存菌种，反复冻融会使细胞收到破坏，微生物死亡。
实验 细菌总数的测定一、测定方法平皿计数法二、方法依据《生活饮用水卫生规范》三、测定范围生活饮用水及其水源水中的细菌总数的测定四、测定原理细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1mL水样所含菌落的总数。
按本作业指导书所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。
五、试剂营养琼脂1、成分A蛋白胨 10gB牛肉膏 3gC氯化钠 5gD琼脂 10～20gE蒸馏水 1000mL2、制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中（如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
六、仪器设备1、高压蒸汽灭菌器2、干热灭菌箱3、培养箱36±1℃4、电炉5、天平6、冰箱7、放大镜或菌落计数器8、 pH计或精密pH试纸9、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等七、分析步骤1、生活饮用水1.1以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
1.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
大肠菌群测定—食品中大肠菌群的测定方法
培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄 糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃， 在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。
➢ 在普通营养琼脂上有3中菌落形 态：
➢ 1）光滑型：菌落边缘整齐， 表面有光泽、湿润、
➢ 光滑、呈灰色，在生理盐水 中易分散；
计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳 糖胆盐发酵管。
•
接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml
以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠
杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。
• 置36±1℃温箱培养24±2小时，如所有发酵管 都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产 气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进 行。
4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
➢ 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录
B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。 ✓注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，
表内的数也应相应减少或增加。
大肠杆菌 0157显色 培养基上 的菌落
在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上
大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征
设备和材料
食品中大肠菌群测定
参考 GB4789．3-2010
➢主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌 属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属 的Ⅲ亚属细菌组成。
3、大肠杆菌的生物学特性
基本形态
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.50.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但 不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛， 但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体 动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微 荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良 好，革兰氏染色阴性。
菌落总数、霉菌和酵母菌总数等微生物检验方法
菌落总数、霉菌和酵母菌总数等微生物检验方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
大肠杆菌及菌落总数
所谓细菌总数是指1mL 或 1g 检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平 板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落 (colony-forming unit ， cfu) 数，故 其单位应是cfu/g(mL) 。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37r 24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称， 主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成， 即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水中大肠菌群的检验方法，常 用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验， 但操作繁琐， 需较多、易于阻塞滤孔的水样。
( 三 ) 实验器材 (1) 菌落总数的测定：1) 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基用玻棒挑取， 放在小烧杯或表面皿中称量，量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然 后立即取出纸片。
在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后， 加入琼脂， 再在石棉上加热使其溶解。
将药品完全溶解后， 补充水到所需的总体 积。
在未调pH 前，先用精密pH 式纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培 养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用PH 式纸测其PH ，直至PH 达 7.6。
反之，用 1moI/LHCL 进行调节。
无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是O.9%:称取O.9克氯化钠，溶解在少量蒸 馏水中，稀释到1OO 毫升。
量筒 玻璃棒 电热炉 称量杯 灭菌三角瓶 灭菌的具塞三角瓶 灭菌平皿 灭菌吸管 灭菌试管高压蒸气灭菌： 1.将内层锅去处， 再向外层锅中加入适量的水， 使水面与三角架相平为宜。
2. 放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）。
要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 lO.Og NaCI 5.0g水 lOOOmL pH7.4 〜7.6将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCI 放入烧杯中，牛肉膏常 用热水溶化后到入烧杯。
食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测实验报告
实验九食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测[实验目的]1、了解国家规定的食品质量与细菌菌落总数和大肠菌群数量的重要关系。
2、掌握食品细中细菌菌落总数及大肠菌群的检测方法。
[实验原理]菌落总数根据稀释平板技术法检测每mL/g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,经37℃、24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
它所反映的是检样中的活菌数，细菌数越多，说明污染程度越大，这项指标可作为判定待测样品被污染的程度。
大肠菌群数是在100mL(g)食品中（或1000 mL水中）大肠菌群最近似值。
它是指肠杆菌科中的４个属，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
这一菌群致病力不强，具有共同特点：好氧和兼性厌氧、革兰氏染色阴性反应、无芽孢杆菌、37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气。
大肠菌群在人畜肠道内含量最多，可随排泄物进入水源或污染食品。
国际公认以大肠菌群的存在作为粪便污染指标。
这项指标可判定待测样品有无被粪便污染及污染的程度。
[实验材料]1、检样牛乳（饮料、酱油）2、培养基普通营养琼脂平板、单料乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、EMB平板3、仪器和其他物品恒温箱、水浴锅、无菌培养皿、无菌吸管、无菌盐水瓶（内装225 mL无菌生理盐水）、无菌试管（内装9 mL无菌生理盐水）、灭菌剪刀、镊子等[实验内容]1、细菌菌落总数的测定(1)制备样品及样品稀释取待测样品（牛乳、酱油）一瓶，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口，若是塑料瓶则用75%的酒精棉球擦拭灭菌。
在无菌条件下取样25 mL放入内装225 mL生理盐水的瓶中，充分混匀，制成10-1的稀释液。
用1 mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL，沿管壁徐徐注入装有9mL无菌生理盐水的试管中（注意，吸管尖端不要触及管内稀释液），振荡试管，混合均匀，制成10-2的稀释液。
另取1mL无菌吸管，按上述操作方法做成10-3稀释液。
每次稀释，换用一支无菌吸管，共做10-1、10-2、10-3三个稀释度，分别含样品0.1mL，0.01mL，0.001mL。
大肠杆菌、菌落总数检测步骤
大肠杆菌及菌落总数检测方法为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。
下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。
一、大肠杆菌：1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）双料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。
单料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。
2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。
（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。
C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。
D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。
E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。
F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。
G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml 吸管取样品液体分别注入双料试管中H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。
I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。
J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。
微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测
实验六水中细菌总数与大肠菌群的检测摘要:本实验以测定公园河流水的细菌总数与大肠菌群的数量,来测定特定地点的水质情况。
初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标,判定水体的质量。
对该实验点的水源作出了定性的评价,以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。
关键字:河流水;细菌总数测定;大肠菌群;EMB培养前言各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关,因而就是评价水质污染程度的重要指标之一。
细菌总数就是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)],可用稀释平板计数法检测。
水中大肠菌群的数量可用来判断水源就是否被粪便污染,并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征:G-无芽孢杆菌,兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。
多管发酵法初发酵:适当稀释样品,乳糖发酵培养,产酸产气;分离培养:伊红美蓝(EMB)平板上划线分离,出现紫色、粉红色特征性菌落;复发酵验证:挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料与方法牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于水中细菌总数测定牛肉膏5g,蛋白胨10g, NaCl 5.0 g,琼脂8g, 蒸馏水1000ml; pH 7、0乳糖胆盐蛋白胨培养基:用于初发酵1×:蛋白胨20g、牛胆盐5g、乳糖10g、0、04%溴甲酚紫水溶液25mL(调pH值后加)、水1000mL、pH 7、2－7、4三倍浓缩液(3×):除水以外,其余成分取三倍用量分装:1×的培养基分装9ml/管, 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶,均装上德汉氏小管。
灭菌条件:115℃,15min。
EMB培养基:用于大肠菌群菌落鉴定脱水培养基,按说明书操作,水用量为90%。
水源:紫竹院河水仪器:高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂:牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂粉,伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0、04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂具体实验步骤:1),相关器械的灭菌操作,以及前往紫竹院取少量的样品水。
菌落总数及大肠菌群测定 - 副本
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升 （ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米 （cm2）报告。
-----大-大肠肠菌菌群群
粪便污染指示菌之一
一、大肠菌群的定义
二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的 卫生意义 三、大肠菌群计数方法：
当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明 显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则 每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开 计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不 到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2代表全平板的菌落数。
如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘 以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情 况计算出的菌落数按估算值报告。
不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平 板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍 数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（ 有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检 样计数报告的依据。
大肠菌群MPN值
指每1g或1ml食品检样中大肠菌群最可能数。
大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示 的卫生意义：
1.它可作为粪便污染食品的指示菌。 2.它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。
大肠菌群的检测：旧国家标准 GB/T4789.3-2003三步法
乳糖发酵试验 分离培养 证实试验
大 肠 菌 群 检 测 程 序
GB/T4789.3-2003版食品卫生微生物学检验 大 肠菌群测定
大肠大菌肠群菌的群定义
具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需 氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。 包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷 伯氏菌属等的一些菌种。
菌落总数的计算方法
菌落总数的计算方法菌落总数是指在一个给定的培养基上生长出的菌落的数量。
菌落总数的计算方法常用于食品和水质检测中，以评估样品的微生物污染程度。
下面是计算菌落总数的常见方法和步骤。
1. 准备样品：将待测样品如食物、水样等取样，确保取样的代表性和无菌操作。
2. 制备培养基：根据待测菌种的需求，选择合适的培养基。
常见的包括营养琼脂、大肠杆菌琼脂培养基等。
按照制备方法制备好培养基。
3. 培养条件：根据待测菌种的生长特性，设定合适的培养条件，如温度、pH值、氧气含量等。
将培养基倒入培养皿中。
4. 菌种接种：将待测样品进行适当的稀释，然后取适量的样品接种到培养基表面。
5. 培养：将接种好的培养皿在恰当的条件下培养一定时间，通常为24-48小时。
6. 菌落计数：在培养皿上观察和计数生长出的菌落。
使用放大镜或计数板进行观察，每次计数一个培养皿，将菌落的数量记录下来。
7. 计算菌落总数：将每个培养皿中的菌落数量相加，得到菌落总数。
通常以“菌落形成单位”（CFU）表示。
需要注意的是，菌落总数的计算方法只能反映出培养基上能够生长的菌落数量，并不能完全代表样品中的所有微生物。
此外，在计算菌落总数时，还需要注意避免菌落的重叠计数和过度稀释样品导致菌落数量偏低的情况。
除了传统的培养计数方法外，现代的快速菌落计数方法也得到了广泛应用。
例如，利用自动菌落计数仪可以实现高通量的菌落计数，提高了检测的准确性和效率。
另外，核酸检测技术如PCR、实时荧光定量PCR等也可以用于菌落总数的估算，这些方法可以快速检测出目标菌种的DNA或RNA，从而估算出菌落的数量。
总之，菌落总数的计算方法是通过培养菌落并计数来评估样品中微生物的数量。
选择合适的培养基和培养条件，进行菌种接种和培养，然后观察和计数菌落，最后得到菌落总数。
现代的快速菌落计数方法和核酸检测技术也为菌落总数的估算提供了更多选择。
食品中细菌总数及大肠菌群值的检测
菌落总数测定——卫生学意义
• 判定食品被细菌污染的 程度及卫生质量。
菌落总数测定流程(倾注平板法)
检样1mL+9ml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
35 ℃ ，48 ± 2h
检测程序
初步发酵试验（产酸产气否？） 平板分离（伊红美蓝鉴别培养基） 革兰氏染色（是否G-无芽孢杆菌？） 复发酵试验（可疑菌落是否产气菌？）
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
• 伊红和美蓝可抑制G+生长； • 不发酵乳糖的细菌菌落无色
透明；
菌名
大肠埃希氏菌
• 能发酵乳糖，产酸力弱，菌 肺炎克雷伯氏菌
卫生学意义
• 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪 便污染指标。
• 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病 菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康 危害性的大小。
• 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
一、目的要求
1.了解食品卫生微生物学的重要性及其原理 2.学会食品中细菌菌落总数的测定方法和平
板活菌计数法 3.学会食品中大肠菌群数的测定方法
二、基本原理
1、食品卫生微生物学指标包括细菌菌落总数、大肠 菌群数和致病菌数量。前两者在日常检测中是必检项 目。
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大肠杆菌及菌落总数检测方法
为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。
下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。
一、大肠杆菌：
1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）
双料试管配制
A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。
单料试管配制
A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。
2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。
（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）
B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。
C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。
D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。
E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。
F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。
G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中
H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。
I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。
J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。
二、菌落总数的测定
1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均匀。
2、分别取15ml平板琼脂液到-1、-2、-3培养皿中，待培养皿液体凝固后将培养皿放入36℃±1℃的恒温培养箱中培养48小时。
3、取出培养皿，用肉眼计数菌落总数。
实验基本完成。
注一：蒸馏水在高温灭菌121℃情况下进行30min灭菌。