引物篇(引物合成及各种问题总结)

引物篇
1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。

对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。

OPC法纯化的DNA纯度大于95%。

适用于40mer 以下引物的纯化。

◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。

◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。

纯度可以大于99%。

主要用于短链和修饰引物的纯化。

该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

3.引物的OD数如何定量？
答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。

测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

DNA干粉
用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。

需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。

根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求
一般PCR扩增< 45base OPC
>45 base PAGE
诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE
DNA测序20base左右OPC
亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE
反义核酸根据实验要求定PAGE
修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC
5.最长可以合成多长的引物？
答：引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率很低。

除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，
80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。

6.需要合成多少OD数？
答：根据实验目的确定。

一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。

但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。

做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。

片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。

超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

7.如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

8.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

引物一般配制成10-50pmol/ul。

溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。

如果不一致，请和我们联系。

我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。

引物的分子量可以从合成报告单上获得。

如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.
9.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
10.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。

如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x 碱基的平均分子量。

或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns–62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，W A, WC, WG, W, Wi 分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。

Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量
Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
常规修饰基团分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引
物粉末收集到管底。

根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。

12.如何保存引物？
答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。

引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。

溶解后的引物-20度可以长期保存。

如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。

修饰荧光引物需要避光保存。

13.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。

如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。

如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。

磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。

SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

15.测序发现引物有突变是怎么回事？
答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。

用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。

我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。

发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。

引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。

引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。

至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。

被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。

对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。

置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。

碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。

脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。

脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。

16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。

引物链越长，突变的频率累加起来就越高。

研究人员总希望合成
的引物万无一失，这种心情可以理解。

但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。

要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。

做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17.如果测序发现突变，该如何处理？
答：对您遇到的困惑，我们表示同情。

遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。

如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。

根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。

一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。

您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。

基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。

但是制备PAGE 电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。

国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。

建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5’端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在68-70C左右。

有用的荧光染料参数
Name Name 吸收波长发射波长colors
6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green
TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange
HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose
ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red
Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red
Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet
20.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在58-60C左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。

投诉者有时心情很不好，还不听解释。

撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。

OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。

下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66
22.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？
答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。

而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB 的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。

所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。

同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果？
答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。

解决办法重新合成或重新纯化。

24.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？
答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。

PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。

如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。

如不明原因，我们免费为您重新合成一次。

如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。

25.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。

使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。

建议分装引物，避免反复冻溶。

建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。

还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

26.引物质量好坏的判断标准是什么？
答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

27.PCR扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。

当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。

如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。

有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1）RT-PCR。

请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。

RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。

（2）从基因组中扩增。

一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。

基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg 和pH。

28.PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？
答：不能。

瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。

一些用户如是说。

我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。

我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。

我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。

我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：
一、GC% GC含量
对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。

产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。

二、Degeneracy 多义性
当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。

三、3’End Stability 3 末端稳定性
引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的 5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。

如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands）。

而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。

四、GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。

这一段有较强稳定性的5 末端称为GC 钳。

它保证引物与模板的稳定结合。

选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。

五、Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。

二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。

六、Hairpin 发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。

发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。

自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。

七、Dimer 二聚体
引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。

它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在 3 末端问题会更为严重，3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。

八、False Priming 错配
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。

3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。

顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用Primer Premier 5.0，因为它界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo，其次我认为是DNAstar。

Oligo功能强大，所以使用起来就没有Primer Premier 5.0那么简便。

先用Primer Premier 5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！
补充一：具体说一下引物中GC含量问题
引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%A T的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% A T的产物。

完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。

补充二：关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）
1、ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。

2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。

二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的
自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。

当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了补充三：关于产物需要测序的PCR引物的设计问题
在DNA测序的PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT 含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。

这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。

其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。

因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA 也形成双链。

与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol 的，通常就是专一性的探针或引物。

寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

以上内容基本涵盖了我设计引物的全部心得和体会，现在全部拿出来给大家分享，希望对大家有所帮助！。