引物设计
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
基
因
工
程
题目:引物设计
姓名:
学号:
专业年级:
请根据以下EST序列设计引物
EST序列名称:BQ168698 GGGTACGGGCCCCCCTCGAGATAGGGCTCCTCCTCTGCGCCGCTAGCTCCTCCCCTTCT CTTACGTCTTCCAGCTAGCTCCTCCCCTTCTCTTACGTCTTCTCGTCCCCGTTCCTCTCA TCTCCCTGCCTGGGTTACCGCCGTCGCCCAGGTGAGTTGTTGCTGGGGGCGGGGCGGG GCGTGCTGGTGCCCTCGAGTTTGCCATTAAGGAAGCCGTAGGTGGAGGTGAGACGCTG CTGGAGTTCAAGGTGGCTGAACACCACGACGGGGCAACAGATCGGCAGCCTGTGGCC CGGACCTCAGGTCCAGTTCATGTTAA TTACCCAAAGCTTGGCGAGTTGTGGTGGTTAAT AA TTGCATTTGCTTTGA TGACACTAGA TCA TTAGTCACCGGATGTTAAGCTCGCTCTGTA GTGTTGCTTACAATATTTCCTCAATTTCCA TTGGTGGGAATTTTGAGTGAGAATGA TCCA CA TGATTGACAAGAACAGGGAATGATTAGCTTCAAGCACATAGCAAAGAATGTGAAAA TAATATATTTAACGTTGTATGGAGATGCAGTACTTGA TGCGGTCCTCTGGATCCGCTGCC CCTCTTTGTTTCTGA
引物长度20bp+4bp
选第10个引物
原因:没有hairpin 、dimer 、False priming ;GC%也没超过60%;Tm 相差不到1;产物也比较大;正反引物的3’端一个是C 一个是G 。经过多次尝试,选前面分数高的引物在加酶切位点时,反而会导致产生各种问题(例如会形成发卡结构、引物二聚体等)的几率上升。
在正义引物的5’端加上EcoRI(GAATTC)酶切位点,再加上保护碱基GG。
同样,在反义引物的5’端加上EcoRI(GAATTC)酶切位点,再加上保护碱基GG。
因为正义引物含有发卡结构,要改动这几个碱基(TCG),3’端的碱基不能轻易动,只能改动5’端。因为TC是酶切位点上的序列,所以不能动,只能把G改成C。
结果形成很多False priming,因此要改动碱基序列。
原本序列5' TGGGAA TTCCGCTGAACACCACGAC 3'
改变序列5' TGGGAA TTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'
直接把T-A,C-G互换,不改变CG含量。
结果还是有False priming,再把
5' TGGGAATTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'换成
5' T CC GAATTCCGC A GA T CA G CA G GAC 3'
结果False priming没有了,但是又有了发卡结构,只能再修改碱基序列。
5' TCCGAATTC G GCAGA TCAGCAGGAC 3'
5' T G CGAATTC G GCAGATCAGCAGGAC 3'
结果如上图
最终引物序列为:
正义引物5' TGCGAA TTCGGCAGA TCAGCAGGAC 3'
反义引物5' CGGGAA TTCAGAGGACCGCATCAAG 3'
(GAATTC 为加入的酶切位点)
正反引物的Tm 值都在72℃左右,长度25bp ,GC 含量56%。
总结:设计引物过程中,发现许多问题,最麻烦的就是加入酶切位点会引起很多参数
(如Tm 值、GC 含量等)的改变,还会造hairpin 、False priming 等,而且每一次修改都可能造成新的hairpin 、False priming 。经过多次尝试,发现改变碱基时,G-C 、A-T 互换可以不改变GC 含量,而且Tm 值得变化也不会太大;每三个碱基替换一个效果会比较好。