脑组织

脑组织

①动物处死2min内取脑组织，选取视交叉后Imm至乳头体之间的脑组织，首

先冠状位向后取2mm的厚度，4%多聚甲醛溶液固定，按照常规脱水、透明、石蜡包埋，切片后进行HE染色

②暴露出大鼠脑组织，用眼科剪轻轻剪断脑底各相连神经，取出完整组织，放

入4%多聚甲醛中固定48一72小时。

腓肠肌

①取腓肠肌，用4℃预冷的生理盐水清洗，去除血污，滤纸吸干水分，锡箔纸

包裹做好标签，浸入液氮3Omin后放入一80℃超低温冰箱冷冻。

②左后肢腓肠肌内侧头中下部1/3处快速取约0.5g组织，用冰生理盐水洗去浮

血，剔除脂肪及结缔组织，液氮速冻后置于一80℃低温冰箱保存以备提取RNA。

③在左后肢胖肠肌内侧头中下部1/3处快速取下约0.5x0.5xlm3肌组织，入4%

中性多聚甲醛固定液中固定，以备光镜组织切片的制备。在每组12只动物中随机取3只动物左后肢腓肠肌内侧头中下1/3处约0.5x0.5x0.1cm，组织块，立即入3%戊二醛固定液中固定，以备透射电镜切片的制备。余下的肌肉经液氮冷冻后，置于一80℃低温冰箱保存待测。

④取双下肢排肠肌，深层腓肠肌放入高压灭菌的冻存管中，于液氮中暂存，编

号后置于一80℃冰箱中保存备用于mRNA及蛋白测定。取一小部分组织置于20%中性福尔马林中充分浸泡24小时后，常规石蜡包埋，切5um厚的切片，留测病理及免疫组化指标。取lm³的组织置于电镜液电留测电镜，其余大部分排肠肌组织置于4℃线粒体提取介质中，以备提取骨骼肌线粒体。

股四头肌

①取出下肢股四头肌，生理盐水漂净血渍后滤纸蘸干，迅速放入-70℃液氮中保

存

②取大鼠左侧股四头肌股直肌深层肌肉约200mg，放入无菌EP管，液氮冻干，

-70℃冰箱保存，待测骨骼肌分子生物学指标。

③取右侧部分股四头肌股直肌，先经异戊烷处理，再用液氮冻干，-70℃冰箱保

存，待做骨骼肌冰冻切片

④完整剥离双侧腓肠肌，冰盐水冲洗，滤纸吸干，电子天平称重。取少许左侧

腓肠肌组织约300mg，按照1：9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，然后在冰浴中电动匀浆、超声粉碎(4次，10s／次，间隔10s)，4℃离心（12000 rpm）15min，取上清，-30℃保存待肌肉组织生化指标。

⑤取出股四头肌，于冰生理盐水中洗净血液，装入样品管中，并迅速将之放入

一84度超低温冰箱中。

⑥开胸心脏放血，提取股四头肌组织，PBS溶液冲洗。切取适量股四头肌组织

置4%多聚甲醛中固定备作石腊切片。剩余的股四头肌组织迅速放入-70℃冰箱保存。

⑦大鼠股四头肌置15%中性福尔马林固定24h以上，脱水包埋:器官经改刀后

置于15%甲醛中24h以上，70%乙醇30h，80%乙醇24h，95%乙醇5h，100%乙醇1h，苯15min，软蜡30min、硬蜡90min、石蜡包埋

⑧取小鼠右腿的股四头肌后，用滤纸吸去残留血液，称重，记录股四头肌重量，

用EP管封闭后直接投入液氮，再转移至一80℃超低温冰箱保存.以备用于RT一PCR测MHC四种亚型的基因表达。

⑨迅速取部分股四头肌以10%多聚甲醛固定，待光镜观察、免疫组织化学分析；

部分以4%戊二醛固定，待电镜观察。

血管

①在无菌条件下取出主动脉弓至肾动脉一段，放入PBS液中。然后再移入超净

台，放入培养皿，剥离血管，沿纵轴切开，摊平，充分暴露内膜，刮取内膜，将内膜组织移入EP管，加入0.smlRNA裂解液(6mol八)，放入冰箱4℃保存

②在无菌条件下取出主动脉弓至肾动脉一段，放入10%福尔马林中固定，梯度

酒精脱水干燥，二甲苯透明，浸腊、包埋，待切片。

③打开胸腔分离并剪下主动脉，去除周围过多的结缔组织，切取胸主动脉上段

10%PBS甲醛固定用于组织学检测；中段，取6mm宽血管条，观察其收缩舒张反应性;下段，液氮贮存，用于测定AGEs、MDA含量，SOD、NOS活性，eNOS、VCAM一1蛋白表达等。

④取主动脉弓-70℃保存，同时部分主动脉弓置入4%多聚甲醛固定液中固定，

待光镜、免疫组化检测

⑤分离背部大血管，固定于10%甲醛，经石蜡包埋后切片备用，行HE染色

⑥快速分离胸主动脉，冰生理盐水洗净后，一部分置入液氮中保存，用作AGEs、

原位杂交、荧光定量PCR等检测；剩下部分主动脉置入福尔马林中固定用作免疫组化及病理检测。

⑦找到并分离胸主动脉剪断，可见大鼠心脏仍呈窦性搏动，自主动脉根部游离

整个心脏，迅速移入预冷的生理盐水漂洗血液，取出吸干后迅速在分析天平上称重，精确至0.00019。取胸主动脉长约3一4cm，心肌大小约Icm3迅速放入甲醛留作HE染色用，取胸主动脉长约Icm，lmm3大小左心室置入戊二醛溶液的小瓶中，送电镜检查。

心

①切取大鼠心脏，去除结缔组织和心房部位，心室称重，用10%甲醛溶液固定

用于组织学检测。

②大鼠心尖部称重后立即加入固定液(4%多聚甲醛/0.IMPBS)中，已固定好的组

织经梯度酒精脱水(70%一80%一90%一100%)、二甲苯透明、石蜡包埋，切片厚度5um，裱于用防脱片剂处理过的干净载玻片上，置于60℃恒温箱内烤片12小时，以备用于HE染色；于左心室取1xlx1mm，的心肌组织放入

2.5%的戊二醛中固定，4℃保存，送电镜观察。

③取心脏、肾脏、脾脏组织，用PBS冲去残留血液,用10%甲醛固定,石蜡包埋

后，切成5μm厚的小块，制成石蜡切片,进行苏木精Hematoxylin&伊红Eosin(HE)染色,在光学显微镜下观察并照相。

④取心肌组织0.2g，加入1ml预冷的裂解液，冰水浴中匀浆，4℃静置1hr，然

后4℃离心13000rpm，30min，取上清于-20℃保存。应用Pierce公司的蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度。

⑤立即取胰岛、心脏、肾脏组织,用4%的多聚甲醛及2%、5%的戊二醛固定后,

组织块再经锇酸缓冲液、醋酸双氧铀固定,丙酮梯度脱水,Epon812环氧树脂包埋,ULTRACUT E/S型超薄切片机切片,醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色,Philips EM400T型透射电镜观察。

⑥取左室中段横截面心肌组织，宽度约2mm，10%甲醛溶液固定，余下的心肌

组织放入无菌冻存管中，保存于一80℃冰箱