慢病毒包装原理介绍

慢病毒包装系统简介及应用

、慢病毒包装简介及其用途

慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载

体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，

不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在

长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。当RNA聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依

赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA

茎环结构(stem loop )。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4〜5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载

体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。

慢病毒载体(Len tiviral vector )较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非

周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周

期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小

鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功

能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培

养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题：

1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi , cDNA克隆以及报告基因的

研究提供了一个有利的途径。

2. 进行稳转细胞株的筛选;

3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；

在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验

能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

三、慢病毒载体介绍

慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs ）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能

高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，

其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体,

进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋

白；或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，

并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢

病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较

低，不影响病毒载体的第2次注射。

四、慢病毒载体的构建

1. 构建原理

慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相

似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat 和rev 。HIV

21是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV 21基因组中的顺式作用元件（如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV 21基因组去除了

包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下

的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒

（RCV ）

的可能性，将包装成分的5 ' LTR换成巨细胞病毒（CMV ）立即早期启动子，3 ' LTR换成SV 40 polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。根

据这个原理，Naldi ni和Kafri 等构建了三质粒表达系统。

2. 三质粒表达系统

三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，

表达HIV 21复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu ;包膜蛋白质粒

编码水泡性口炎病毒G蛋白（V SV 2G），应用VSV 2G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质

粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE,并在其中插入目

的基因或标志基因（绿色荧光蛋白GFP）。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生RCV的可能性。通过三质粒共转染293T细胞，超速离心后