生物技术药物反义核酸与核酶

c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
互补 RNA
c-myc
C-MYC
反义RNA的作用机制
作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接 反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻
止特定基因的转录 互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及
其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNase H使
mRNA易被核酸酶降解 作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成
熟 作用于PoIy A形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运
反义RNA的作用机制
m7G5'ppp rRNA
某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA 以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的
反义DNA与靶基因结合形式
寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性
寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物， 激活RNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNA
生物技术药物
朱俊铭
2011年10月
主要内容
绪论 动植物细胞培养生产医药用产品或原料 转基因动植物作为药物生物反应器 抗体工程药物 干细胞与治疗性克隆 基因工程疫苗与DNA疫苗 基因药物 反义核酸与反义技术 生物技术药物新药与专利申报 生物技术制药产业化个案
反义药物
主要内容
一、反义核酸与反义技术
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为 反义链
精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7到30个核苷酸组 成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内， 干扰特定基因表达
利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、 mRNA及蛋白水 平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡
GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达
反义RNA的临床作用
抗病毒： 将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA
表达载体 再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义
RNA 从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流
感病毒、人类免疫缺陷病毒） 抗肿瘤： 设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
二、核酶技术及其应用
反义核酸和反义技术概念 反义核酸的基本原理 反义核Fra Baidu bibliotek的种类 反义核酸与反义技术的应用
核酶概述 核酶与RNA修复 核酶技术在临床上的应用 核酶技术面临的问题
反义核酸和反义技术
反义核酸(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而 在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设 计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点
RNase H ASODN mRNA
TFO
反义寡聚核苷酸与 mRNA特异性结合， 阻断翻译过程
反义技术与反义核酸的应用
Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry
PHARMACEUTICALS
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标mRNA作用
以第二种为主来介绍
反义核酸的种类
反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散 的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达
反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序 列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一