生物技术药物反义核酸与核酶
反义核酸与核酶
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
生物技术制药重点总结
1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。
2.生物技术药物：采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。
3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。
分三种构型：共价闭合环状DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。
在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。
5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性的扩增DNA。
在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。
6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。
cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。
7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。
②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。
第16章 反义核酸类药物
第一个反义药物——福米韦生
5 适应证和禁忌证
福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效 果或有禁忌的病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗 的病人，以免增加发生眼内炎的危险性 6 与治疗CMV视网膜炎的其他药物比较
更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；具有交 叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术 以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限 福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而 轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法
硫代磷酸化修饰
主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
第一个反义药物——福米韦生
1 药ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ学
1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活
抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据
核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的
一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
ASGP-PL-反义RNA复合物 → 肝细胞表面ASGP受体识别→ 吞噬 → 释放 → 发挥作用
优点：专一性强，抗降解能力强
反义核酸药物
Replication of the ColE1 Plasmid
• ColE1 replication is unidirectional
ColE1 (6646 bp)
Replicon
RNAI
Origin RNAII
Colicin
2、在转录水平上：
反义RNA可与mRNA 5’-端互补,从而阻止了RNA的完 整转录。 ➢ 大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种 小分子反义RNA的制约。这种反义RNA可与CRP基因转 录起始生成的mRAN分子的5’-端序列互补，形成特异的 二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄-环结构， 空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停止转录。
?另外在核酶基础上人们又提出了反义核酶的概念即通过基因连接将反义rna与核酶的基因连为一体即通过基因连接将反义rna与核酶的基因连为一体再转录得到具有双重功能的一类rna分子再转录得到具有双重功能的一类rna分子对靶基因既有封闭作用对靶基因既有封闭作用又有切割作用
反义核酸药物
一、概述
1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来 特异性地抑制基因表达的设想。
但由于PS-ODN其本身带有大量的负电荷，能与 多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂 量依赖的毒副作用。
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′ 连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别 磷酸二酯键。
➢α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。 ➢1’位取代、2’位取代: 指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。 如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后,也使asＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
反义核酸药物剖析
二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄 - 环结构，
空间构象障碍迫使 RNA 聚合酶脱离 DNA 模板，停止转录。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译； 2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始； 3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的
导入方法
1、RNA病毒感染;
2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外 ,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加 as
ＯＮ到达靶细胞的能力。
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
浅谈核酸药物
PCR技术的应用，使得Aptamer的研究近年来有了长足的进步，筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Apta-mer)。
这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA等多种形式的寡聚核苷酸，其配体的性质各异。
用于抗病毒的aptamer多为RNA分子，与基因表达调控有关的重要病毒蛋有什么不妥。
但对白就不行了，人说话的声音受情绪控制的，拍摄时表演的情绪在后期很难模仿到一模一样，就算能模仿，那等于让演员重演一边，而且还要花时间、花场地、花设备。
所以我们看电影拍摄花絮中的场景，拍摄的时候，只有一个专门录对白的话筒。
而其他的声音，可以在后期再录，或直接从音源库里找，然后根据画面进行“配音”就可以了。
3后期编辑电脑配置专业用于后期编辑的系统是计算机技术和数字电视技术相结合的产物，它主要有三部分组成：音频处理卡（即声卡）、视频处理卡（包括视频采集卡和视频压缩卡）以及编辑软件。
用来视频编辑的电脑，最大的区别就是是否有采编卡。
业余领域多半是无卡编辑，通过1394接口或者USB接口把摄像带的内容传输到电脑硬盘中，生成为A VI文件，然后用计算机软件对视频进行后期编辑制作，生成一个新的A VI文件，最后再将视频用专用的压缩软件将编辑好的A VI文件压缩成为MPEG1或MPEG2文件，刻为VCD或DVD永久保存。
任何后期编辑的工作流程，都可以简单地看成输入、编辑、输出这样三个步骤。
当然，由于不同软件功能的差异，其使用流程还可以进一步细化。
一般来说，素材的采集与输入采集主要是利用Premiere Pro软件,将模拟视频、音频信号转换成数字信号存储到计算机中，或者将外部的数字视频存储到计算机中，成为可以处理的素材。
4剪辑软件的横向比较在后期编辑上，目前主要采取无非线性编辑系统，非线性编辑系统是建立在计算机平台上的视频编辑应用系统。
它是集合传统的线性编辑系统里的全部设备为一体的编辑系统。
随着计算机软件方面的逐步发展，“无卡非线性编辑系统”问世，无卡非线性编辑系统造价低廉，它弥补了非线性编辑卡价格昂贵的缺陷，成为DV影片后期编辑的首选。
反义药物的简介
反义药物的简介反义技术是近些年来发展的一种全新的药物设计方法，它所合成的反义药物作用非常的大，那你了解反义药物吗?下面是店铺为你整理的反义药物的简介的相关内容，希望对你有用!反义药物的简介反义技术(antisense technology)是近些年来发展的一种全新的药物设计方法，主要是根据碱基互补配对原则和核酸杂交原理，利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段，与目的基因(单链、双链DNA)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合，从基因复制、转录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达，干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递，从而达到抑制、封闭或破坏靶基因的目的。
利用这一技术开发的药物称为反义药物，通常是指反义寡核苷酸，即人工合成的DNA或RNA单链片段，主要包括反义DNA(AS-ODN)，反义RNA(ASON)，多肽核酸(PNA)，核酶(ribozyme)等。
反义药物的优缺点优点特异性较强，一个15聚体的反义寡核苷酸含有30-45氢键，而低分子的传统药物(200-600u)与靶点一般只形成1-4个键;信息量较大，遗传信息从DNA-RNA-蛋白质，用互补寡核苷酸阻断某种蛋白的合成是很准确的;反义药物以核酸为靶点，与蛋白质作为靶点比较，更易合理设计新药物。
由于作用于遗传信息传递的上游，所需药量较低，副作用可能较少。
缺点剂量依赖性的副作用,包括脾肿大、血小板减少、免疫刺激、肝中酶 (天冬氨酸转氨酶 ,丙氨酸转氨酶 )水平升高、部分凝血致活酶的活化时间延长和补体的活化等。
反义药物的研究进展反义药物研究始于1978年，以后随着人类基因组计划的飞速发展以及针对某些发病率高又暂无有效治疗药物的疾病，反义药物治疗的研究兴趣逐年高涨。
目前已经证实许多疾病的病因与基因有关。
第一代反义药物第一代反义药物是由合成DNA单体制成的。
它经修饰后仅含一种硫磺物质，以替代核苷酸之间磷酸连接的氧分子。
迄今，由于这种称作硫代磷酸酯变体的硫代磷酸醋寡脱氧核昔酸(PS-ODN)在遇到组织核酸酶时能提高药物的稳定性，并且能延长血桨的半衰期，所以它广泛应用于多数寡脱氧核苷酸类药品中。
核酶的发现与应用
U pA G pU 5'外显子3'外显子内含子核酶的研究进展摘要： 80年代初，由美国科学家Cech 和Altman 发现了核酶,随着人类基因工程研究的深入，工作者和基础科学研究人员开始注意到核酶在各方面的应用潜力。
关键词： 概念 分类 剪接机制 反义核酸技术 医学上的应用 应用实例 技术问题核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一R NA 分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DN A, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的分类剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
、作用机制：通过既剪又接的方式除去内含子 。
需要鸟苷酸或鸟苷及镁离子参与剪接机制：I 型内含子的结构特点： 1、拼接点序列为5’U··· ···G3’ 2、中部核心结构3、内部引导序列pGpA G pU 3'U 5'OH4、剪接通过转酯反应进行剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。
这类RNA进行催化反应时只切不接。
类型：1) 自体催化剪切型2) 异体催化剪切型。
特点：在Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5‘-OH 和2’, 3‘-环磷酸二酯末端。
核酶的应用核酶是在对多种植物病毒卫星RNA及类病毒RNA的自我剪接研究中发现的，数量较少，常见于rRNA的内含子。
核酶的具体作用主要有：1.核苷酸转移作用。
2.水解反应，即磷酸二酯酶作用。
3.磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。
4.脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。
RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。
核酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
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TFO
反义寡聚核苷酸与 mRNA特异性结合， 阻断翻译过程
反义技术与反义核酸的应用
Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry
PHARMACEUTICALS
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为 反义链
精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7到30个核苷酸组 成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内， 干扰特定基因表达
利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、 mRNA及蛋白水 平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡
二、核酶技术及其应用
反义核酸和反义技术概念 反义核酸的基本原理 反义核酸的种类 反义核酸与反义技术的应用
核酶概述 核酶与RNA修复 核酶技术在临床上的应用 核酶技术面临的问题
反义核酸和反义技术
反义核酸(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而 在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设 计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点
GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY
其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNase H使
mRNA易被核酸酶降解 作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成
熟 作用于PoIy A形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运
反义RNA的作用机制
m7G5'ppp rRNA
某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA 以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的
反义DNA与靶基因结合形式
寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性
寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物， 激活RNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNA
反义RNA的临床作用
抗病毒： 将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA
表达载体 再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义
RNA 从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流
感病毒、人类免疫缺陷病毒） 抗肿瘤： 设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
生物技术药物
朱俊铭
2011年10月
主要内容
绪论 动植物细胞培养生产医药用产品或原料 转基因动植物作为药物生物反应器 抗体工程药物 干细胞与治疗性克隆 基因工程疫苗与DNA疫苗 基因药物 反义核酸与反义技术 生物技术药物新药与专利申报 生物技术制药产业化个案
反义药物
主要内容
一、反义核酸与反义技术
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
互补 RNA
c-myc
C-MYC
反义RNA的作用机制
作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接 反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻
止特定基因的转录 互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标mRNA作用
以第二种为主来介绍
反义核酸的种类
反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散 的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达
反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序 列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
Байду номын сангаас
阻断表达
反义技术的两种技术路线
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达