基因治疗与反义药物

四、单纯疱疹病毒载体
单纯疱状病毒是双链DNA病毒
第四节 基因治疗的非病毒载 体
一、脂质体
阳离子脂质体 阴离子脂质体 pH敏感型脂质体 融合脂质体
二、阳离子多聚物
利用DNA的电负性，可以和电正性的氨 基基团相互作用，形成稳定的多聚物， 使DNA不易被核酸酶降解，并可防止大 的复合物在短时间内沉淀，从而提高转 染效率
二、腺病毒载体
腺病毒是双链DNA病毒 腺病毒通过大量复制DNA和蛋白质，并 包装成病毒颗粒，严重地阻碍宿主细胞 的DNA和蛋白质的合成，使细胞营养枯 竭而死亡 腺病毒主要感染上皮细胞，产毒性感染 主要发生在肠胃道、呼吸道和眼部上皮 细胞
三、腺相关病毒载体
腺相关病毒是单链线状DNA病毒，最初 在腺病毒液中发现 腺病毒必须在外界刺激因子作用下发生 复制性感染，一般情况下以潜伏状态与 宿主共存 偏向于整合到人基因组19号染色体的长 臂上
二、反义核酸药物特点
1）高度特异性 2）高效性 3）最优化的药物设计 4）低毒、安全 5）制备简单
三、反义技术的分类
1. 反义脱氧核苷酸（ODN） 又 称 反 义 DNA ， 通 过 与 mRNA 的 结 合 形 成 DNA-RNA杂合体，从而影响基因的表达调控。 由于DNA序列合成仪的广泛使用，所以ODN很 容易获得 2. 反义RNA 反义RNA是与能mRNA序列互补配对形成双 链复合物的RNA片段，影响基因的翻译
三、质粒DNA
质粒DNA就是在体外将目的基因及其所 有的顺式调控元件 质粒DNA的基因转移为非整合性，但是 转染效率低，难以在细胞中长期表达 质粒DNA可以采用三种方式注射到机体 内：裸露DNA直接注射，目前在骨骼肌 和心肌中表达最好；将DNA包裹在脂质 体中注射；受体介导的基因转移，将 DNA与配体相连，增加DNA的定向导入
第六节 反义技术概论
一、反义技术与反义核酸
反义技术是指用人工合成或生物合成的 核酸分子,抑制、封闭、破坏靶基因的技 术。反义技术中的核酸分子可以是DNA， RNA或者肽核酸 反义技术中所用的核酸，一般又称为反 义核酸，就是根据碱基互补配对原理， 结合并调节靶基因活性的核酸分子 通过翻译技术制备的药物，就是人们常 说的反义药物
四、其他非病毒载体
1. 脂质／DNA／多聚物 结合脂质体和阳离子多聚物的优点，将脂质体、 DNA、多聚赖氨酸混合制备而成。 2. 生物高聚物――DNA微球体和纳米粒 生物高聚物如白明胶、壳聚糖等，可以包裹或 结合DNA，形成微米级或纳米级的药物 3. 利用微生物或其他成分构建的载体 如利用病毒外壳蛋白的运输能力，来介导基因 的转移
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，是由于人 免疫缺陷病毒HIV感染，特异性地破坏了免疫 细胞CD4 ＋ ，使机体发生免疫缺陷，造成机体 发生肿瘤、机会性感染的一种致死性疾病 HIV病毒是单链的RNA逆转录病毒，其外壳糖 蛋白Gp120可以和CD4特异性高亲和力结合， 使CD4＋T细胞减少，并使细胞因子的分泌功能 受阻，引起机体的免疫缺陷
1. 反义核酸
用互补于mRNA的DNA或RNA，在细胞 内形成双链分子，阻碍mRNA的剪接、 运送、翻译，降低mRNA的稳定性，从 而影响病毒基因的表达与复制。目前需 要解决的问题是反义核酸的专一性转移 和进入靶细胞之前的降解
2. 核酶
核酶是具有催化RNA自我剪切反应的核 酸，目前报道的核酶是在培养细胞上干 预HIV基因的表达 核酶的稳定性比较低，生理条件下反应 缓慢是其用于抗HIV的不足之处，同时针 对它在机体内是怎样被转录和转录后抗 RnaseH的能力还需进一步研究
4. 自杀基因的治疗
自杀基因疗法的基本思想就是将编码某 种特殊酶的基因导入细胞，使无毒的前 体药物转变为有活性的毒物，引起靶细 胞的死亡
5. 肿瘤疫苗
从基因治疗的角度来看，肿瘤疫苗就是 将肿瘤的组织特异性抗原的基因，导入 到机体内，表达出的抗原，激发机体的 免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤
二、基因治疗与艾滋病
4. 特异性抗体的诱导
诱导机体产生抗HIV的特异性抗体也是抗 HIV治疗的一个重要方法，将gp120的基 因导入人体中表达，诱导抗包膜蛋白 Gp120的体异性抗体，不仅可以诱导产 生IgG，而且可以引发特异性的细胞免疫
5. Tat蛋白突变体表达
Tat蛋白在HIV病毒基因的复制和转录过 程中有着极为重要的反式调控作用，将 突变体形式的tat基因导入人体后，突变 体的大量表达，竞争性地结合Tat受体位 点，抑制或干扰HIV病毒基因组的正常复 制和转录功能
二、基因治疗中的问题
安全性 高效的靶向性基因导入 外源基因表达的可控性 治疗基因过少
第三节 基因治疗的病毒载体
用于基因治疗的病毒载体系统 应该具备条件
携带外源基因并能包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达 对机体不致病
一、逆转录病毒载体
转录病毒是一类正链RNA病毒，可以逆 转录成DNA，以前病毒形式存在，前病 毒还可以整合到基因组上，和宿主细胞 长期共存
二、基因治疗的方法
1. 基因增补
基因增补就是将正常的基因导入病变细 胞或其他细胞，以补偿缺陷基因的功能 或调整细胞的某些功能 基因增补是目前最常用的基因治疗方式
2. 基因替换
用同源重组或者基因打靶技术，用正常 基因替换整个致病基因，使致病基因得 到永久更正 这种以正常基因替换致病基因的方法是 最为理想的基因治疗，但是目前技术手 段，体内重组的频率还太低，只有百万 分之一左右
第七节 反义技术原理和方法
一、反义脱氧核酸
天然存在未经修饰的磷酸二酯脱氧化核 苷酸（PO－ODN）作为反义药物虽然有 和靶RNA发生特异序列结合，激活 Rnase H的活性，但是在生理条件下， PO-ODN对核酸酶很敏感，易被快速降 解，限制了它的实际使用
1. 第一代――硫代寡聚核苷酸 （PS-ODN）
3. 基因修复
是指将致病基因的突变碱基在原位进行 纠正，而正常的部分予以保留 这种方法是最理想的基因治疗方法，但 是目前还没有成功的报道，只是一种理 论上的理想的方式
4. 基因修饰
基因修饰是指将目的基因导入病变细胞或者其 他细胞，目的基因的表达产物特异性的修饰突 变缺陷细胞的功能或者使原有的功能得到加强， 但致病基因本身并没有改变 与基因替换和基因修复相比，这种方法比较容 易实现，也是基因治疗最常用的方法之一
6. 免疫基因的治疗
将抗体、抗原、细胞因子的基因导入患者 的体内，改变免疫状态，以达到预防和治 疗疾病的目的 将抗原基因导入机体内，可以理解为是一 种DNA疫苗，特别是治疗性的核酸疫苗
7. 自杀基因治疗
这是一种肿瘤的治疗方法，是指向肿瘤 细胞中导入一种基因，基因产物为一种 酶，它可以将无细胞毒性的药物前体转 化为毒性代谢产物，将肿瘤细胞杀死， 又称为活化前体药物基因治疗，这种基 因也就被称为“自杀基因”
分离出具有特定功能的特异性基因 获得足够量该基因的载体或细胞 建立有效的途径将外源基因导入机体内 进入宿主细胞的外源基因必须产生足够 量的产物，维持适当的时间，且不产生 有害的副作用
1. 选择目的基因的原则
待研究基因的异常是发生疾病的根源 该基因遗传的分子机制已经研究清楚 基因已经被克隆，且表达机制研究得较 为清楚 转移的基因最好能够完整、稳定地整合 到受体细胞的基因组上，并且适量表达 功能蛋白 有合适的启动子控制、完整的信号肽等
3. 核酶 核酶存在于生物细胞中，是一类具有催 化活性的RNA分子，具有核酸酶的水解 活性，可以特异性地剪切RNA分子 4. 三链形成寡核苷酸（TFO） 三链形成寡聚核苷酸是指可与双链或单 链DNA形成三股链，从而抑制基因转录 的寡核苷酸 5. 肽核酸（PNAS） 肽核酸是以肽为骨架的DNA类似物，是 用手性不对称的中性肽链骨架置换脱氧 核糖磷酸而成
2. 受体细胞选择的原则
最好选择组织特异性细胞，以便使外源基 因只在该特异性组织细胞中表达，而在其 他组织中不表达或表达水平很低 细胞易于从体内取出，有增值趋势，且生 命周期较长 离体的细胞能接受外源基因的转染 细胞经过体外操作能够存活下来，并能安 全输送回体内
3. 载体的选择
作为一种基因载体，易于导入到受体细 胞 调控基因复制、表达等元件，在宿主细 胞中能适量表
第五节 疾病的基因治疗
一、基因治疗与肿瘤
肿瘤的基因治疗，根据作用机制可以分 成两类 调节机体免疫 利用正常细胞和肿瘤细胞的差异。
1. 导入细胞因子基因进行治疗
许多细胞因子，如干扰素、白介素、肿 瘤坏死因子、粒细胞－巨噬细胞集落刺 激因子等，都有提高人体免疫力，抑制 肿瘤的作用
2. 导入MHC的基因治疗
3. 可溶性CD4分子的表达
编码CD4的基因已经得到了克隆，并已 经在真核系统中表达。将CD4分子的编 码基因通过逆转录病毒载体导入到外周 淋巴细胞、骨髓造血干细胞、血管内皮 细胞、血管平滑肌细胞中得到表达，表 达出来的CD4分子可以与入侵的HIV病毒 包膜蛋白Gp120结合，竞争性地保护 CD4＋T淋巴细胞不受或少受感染
2. in vivo
将外源基因装配与特定的真核表达载体， 直接导入体内 载体可以是病毒型的或者非病毒型的， 甚至可以是裸露的DNA 这种方式比较容易大规模生产。但是必 须保证载体的安全性，而且进入人体后， 能导入靶细胞并稳定表达达到治疗目的
第二节 基因治疗的原则和问题
一、 基因治疗的原则
基因治疗的步骤
8. 耐药基因治疗
耐药基因的治疗是指为了提高机体耐受 肿瘤化疗药物的能力，将产生抗毒性的 基因导入人体细胞 如向骨髓干细胞中导入多药抗性基因 mdr-1，使机体耐受更大剂量的化疗
三、基因源自文库疗的途径
ex vivo
in vivo
1. ex vivo
是指将含外源基因的载体外导入到人体 自身或异体细胞（异种细胞），经体外 细胞扩增后，输回人体 这种方法简单，溶液操作，而且外源物 质能被稀释并清除。但是载体系统不易 形成规模，而且需要专门的临床基地
主要组织相容性复合体（MHC）是具有 个体特性的抗原系统 肿瘤细胞免疫逃逸机制中一个重要方面， 就是肿瘤细胞上的MHC表达很弱或者不 表达，使机体免疫应答不能发生
3. 导入抑癌基因的基因治疗
很多肿瘤细胞的某些基因异常表达，被 称为癌基因，当他们处于正常状态时， 就称为原癌基因 机体正常细胞存在抑制细胞异常增殖的 基因，即抑癌基因，它们在细胞周期的 调控和细胞凋亡中，起着非常重要的作 用 肿瘤细胞中，抑癌基因往往会产生突变、 重排或缺失或者表达异常。
5. 基因失活
利用反义技术将反义寡聚核苷酸或反义RNA导 入细胞，特异性地封闭某些基因的表达，以达 到抑制有害靶基因的表达作用，也就是人们通 常意义上所说的反义疗法 引入的反义物质，可以通过和基因组DNA结合， 降低或阻止转录的发生，也可以通过和mRNA 的结合，阻止或降低蛋白质的翻译，还可以通 过核酶降解mRNA 许多肿瘤的发生都涉及多重癌基因及相关基因 的激活并过度表达，抑制这些基因的表达导致 肿瘤细胞发生逆转
基因治疗与反义药物
陈华 陈俊吉 王亦枫 肖阳 方友
第一节 基因治疗概论
一、基因治疗的概念
凡是将新的遗传物质转移得到某一个体 的细胞内，使功能正常的但表达量很低 的基因、机体本身不存在的外源基因得 到正常表达，或者降低、抑制机体基因 的表达，从而达到治疗的目的，这种治 疗方法就称为基因治疗
基因治疗的对象是人体，因此基因治疗 要求确保有效和安全，其难度远远高于 在表达系统中表达的基因工程技术 近些年来，基因治疗取得了重大进展， 研究内容也已经从单基因的遗传病扩大 到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管和神 经系统等方面疾病
以一个硫原子取代了核酸中磷酸的非桥 羟基上的氧原子 显著地提高了化合物在各种环境中对核 酸酶的稳定性，而且保留了在交亲和性 以及对RnaseH的激活活性 第一个获得美国FDA批准的反义药物弗 米韦新
2. 第二代――混合骨架寡核苷酸 （MBO）
典型的MBO为三明治寡核苷酸 中间是PS-ODN片段 ，能够提供激活 RnaseH活性的信息 5端和3端为对核酸酶稳定的修饰寡核苷 酸，主要是对核糖的2号位烷基化的PSODN 一个MBO分子通常由中间8～10个碱基 的PS-ODN和两端的4～6个甲基化的PSODN组成