第6章基因药物治疗

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反mRNA药物 前景光明
• 基因转录本mRNA的结构最为简单，同时在
数量上又远远少于蛋白质，目前所见的基因 药物大多数为反mRNA药物．在此领域的研 究日新月异，新思路、新技术方法不断涌现 • 研究功能基因mRNA的结构，发展针对 mRNA的各种核酸药物：即反义寡核苷酸、 特异水解基因mRNA的核酸酶(ribozyme和 DNAzyme)以及具有干扰作用的双链 RNA(siRNA)是目前研究基因药物的最佳策 略
基因药物优势
• 基因药物则主要针对功能基因组、和
基因转录本mRNA等两类生物大分子
反基因组DNA为药物靶标的不足
• 基因DNA和组蛋白等因为形成复杂结构，使得小分子 •
药物可及性差 基因剔除方法目前还仅仅处在实验室的细胞株以及动物 模型实验阶段，尚不能预见未来是否能应用于疾病治疗 TFO和针对启动子区序列的decoy序列寡核苷酸虽然可 以阻止转录因子同基因启动子结合，从而阻止基因转录 表达，但因为启动子序列一般为细胞功能基因所共有， 所以他们不能特异消除某种基因表达 因此，以反基因组DNA为药物靶标的反基因药物离应 用用尚有较大差距．
• 最大的优点是 在操作过程中只有第一
步有RNA分子的参与，其余分析均是 针对DNA分子，因此容易操作 据此方法已成功地筛选了Ras、人 INF—r基因mRNA的靶位点序列．
• RSL 法
RNA核酶文库方法(random selection library，RSL) 2001年Pan等建立。 通过构建一个RNA序列库及中间两个碱基 均为GA的随机寡核苷酸库，可识别靶RNA 上含UC的序列．使这个库与靶RNA杂交， 筛选出结合的引导RNA，并将其逆转录为 cDNA．将这些cDNA克隆化，并分析其序 列，便可确定出靶位点．
• 同时根据这些序列可以设计锤头状核酶.由
于核酶所识别并切割的序列广泛存在于各 种细胞及病毒ＲＮＡ中,因此这是一个非常 有用的筛选可接近位点的方法,也是一种新 型的反义药物设计方案.
• MAST 法
RNA分子和随机寡核苷酸库液相杂交位点分析法 (mRNA accessible sites tagging，MAST)， 先将RNA分子标记并固定于磁珠上，和两端设计 已知引物序列的随机寡核苷酸库在液相中杂交， 通过淘洗，获得结合的随机寡核苷酸序列，再通 过克隆，测序和序列分析便可获得RNA分子的可 接近位点 该法快速、简单，而获得的位点经证明结合性能 高效，已经实现高通量操作．目前已经运用于许 多基因的功能研究和药物筛选研究，例如与神经 细胞生长相关的小鸟苷三磷酸酶的RhoA基因
• 因此，仅根据mRNA一级结构设计寡
核苷酸是不可靠的，发展筛查mRNA 分子结构靶点的技术，是现代生物技 术研究的重要任务．目前国际上的临 床应用抗癌反义核酸药物有20多例， 也都建立在筛选获得了mRNA结构靶 位点的基础上．
核酶的设计
• Ribozymes/DNAzymes的设计也要
求建立在mRNA的位点基础之上.实验 表明，作用在mRNA的结构可及位点 的核酶比非可及位点位置的核酶具有 更高效水解mRNA的活性
mRNA结构靶点研究新技术
分为两大类 • mRNA的实测分析
• 计算机辅助软件预测分析
mRNA的实测分析
• RNA酶谱分析
92年Lima等运用多种特异性RNA酶 RNaseT1、V1、CL3、A和Sl裂解分析 RNA的特定结构．据此可以收集到RNA的 全部结构信息，确定出其结构图谱，但是 只能分析短序列基因
• 不足:计算机模拟分析法没有考虑
mRNA与胞浆成分的相互作用，由于 新生的mRNA 分子并不是最低自由能 结构，获得的位点可能无效．另外对 较大的mRNA分子，无法从获得的预 测结构中选取最佳结构序列．因此模 拟预测方法与实测方法相比差异较大、 成功率不高．
mRNA靶点的确认
• 体外作图分析:
• RT－ROL 法
随机寡核苷酸库结合逆转录法(reverse transcriptase with random oligonueleotide libraries，RTROL) 将一个随机寡核苷酸库与靶RNA杂交，其 中每一个寡核苷酸序列的5′端均连接了一 个已知序列的片段．然后在逆转录酶的作 用下，以靶RNA为模板，在那些与靶RNA 结合的寡核苷酸序列引导下逆转录．再将 逆转录产物经PCR扩增并分析其序列及与 RNA结合的位置来确定可接近位点的位置
• 就反义核酸基因治疗来说，目前有20
多个针对卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、 结肠癌、实体瘤等肿瘤发生相关基因 的反义核酸药物进人工I～Ⅲ期临床研 究
• 临床I期 ；
H-ras基因反义核酸治疗实体瘤 • 临床Ⅱ期； c-myc基因反义核酸治疗心血管疾病(AVI Biopharma公司)． • 临床3期； 细胞程序性死亡抑制基因bcl-2反义核酸治 疗实体肿瘤、非何杰森病
研发基因药物的关键
• 设计反mRNA基因药物(反义核酸、
核酶、siRNA)时，首先要找准作用 于RNA分子的部位(靶点)
• mRNA分子有一级百度文库构，而且有高度折叠的
二级及三级结构，除了应考虑他们与靶RNA 分子的序列匹配性，即两种分子在一级结构 (序列)上应互补，还应该考虑RNA分子高级 结构的可及性(accessibility，或可接近性)。 一般认为靶点主要处于可及位点(accessible site，或称可接近位点)，而可及位点即指 mRNA高级结构上能识别并结合的位点．找 到RNA可接近位点是成功设计特异结合而能 发挥最高效果的关键．
基因药物作用对象
• 致病基因 • 外源致病微生物基因
• 基因的核酸药物制剂研究开始于70年
代中期，第一个反义核酸药 Vitravene于1998年和1999相继在 美国和欧洲上市. • 目前全球已有近30个药物和治疗方案 进入临床试验，治疗病人总数已接近 1000人，其中以癌症为首位，涉及炎 症、糖尿病，心血管疾病和AIDS等病 毒感染疾病．
主要方法性能比较
计算机辅助软件预测分析
• 用计算机辅助软件预测分析获得RNA的可能
位点，从而设计合成可能的寡核苷酸进行实验 分析，以期发现高效寡核苷酸，为廉价可尝试 的方法． • 多种计算机软件可用干分析RNA的二级结构 常用的有RNAstructure(http：／／ 128．151．176．70／ RNAstructure．html)和Mfold(http：／／ infold2．wustl．edu／—mfold／ma／ forml．cgi)
siRNA的设计
• siRNA的设计是否应该考虑mRNA的
高级结构? 近年来，很多实验室没有注意siRNA 的设计应考虑mRNA的高级结构可及 性
• Vickers等发表了4个基因的80条反义核酸
和siRNA研究工作，将反义核酸和siRNA 进行了系统比较(04年JBC杂志)． • 结果显示:siRNA和反义寡核苷酸的作用能 力、最大效果、持续时间、序列特异性均 表现出相似性，两组药物活性的高低都表 现为基因mRNA结构位点序列依赖，显示 核酸药物活性的高低受靶mRNA二级结构 的影响
• 寡核苷酸微阵列法
94年Southern设计寡核苷酸微阵列法 需要DNA合成和芯片杂交系统，还需要设 计覆盖整个基因的寡核苷酸，及原位合成 系列寡核苷酸，耗资巨大，需要特定的芯 片操作仪器设备，使普通实验室难实 现．依赖主观设计经验，容易忽略真正靶 点
• 基因步测法(gene walk ）
96年Monia建立
在体外，为了验证通过筛选技术获得的位 点而设计的反义寡核苷酸，需要分析寡核 苷酸介导RNaseH对 mRNA的切割作用 • 在细胞内，也可将反义核酸导人培养细胞 或实验动物体内进行试验，分析基因表达 受到抑制的效果，来验证和判断．
评价培养细胞内或动物体内核酸对基因表达 抑制效果，采用蛋白表达分析(Western blot，抑制效果体现于蛋白量的表达变化) • 基因mRNA转录水平进行表达水平分析(定 量PCR或设立以三磷酸葡萄糖脱氢酶 G3PDH基因为内参对照组的Northern印 迹分析)．
第七章 基因药物治疗的现状及对策
罗建新
提纲
• 概述 • 基因药物作用对象 • 理想的基因药物靶标 • 研发基因药物的关键 • mRNA结构靶点研究新技术 • mRNA靶点的确认
概述
• 生物技术药物以人类体细胞的基因组、
转录本组和蛋白质组三个层次生物大 分子为目标，基因药物的研究主要针 对致病基因的DNA和基因转录本 mRNA两类生物大分子
理想的基因药物靶标
• 蛋白质药物研发的困难
体现细胞功能的蛋白质是传统药物作用的靶 标，如今仍然是蛋白质组计划寻求的药物 靶．然而，人体细胞约有3~4万种基因，能 产生约50~100万种蛋白质，阐明如此浩大数 量的蛋白质，和动态变化的蛋白质组以及网络 式关联的蛋白质间相互作用非常困难，以蛋白 质为药物靶标、从蛋白质的相互作用中遴选出 功能蛋白作用靶，研发生物药物面临着巨大挑 战．
核酸药物治疗靶基因
• 致病靶基因 癌基因、抑癌基因、生长
因子及其受体、细胞信号转导系统功 能分子、细胞周期调控物质、酶类等 基因 • 外源致病微生物 如HIV，SARS的结 构基因
• 人体细胞中大多因为致病基因过表达
或者异常表达(不适当的时间或地点表 达)而导致了人类疾病发生．许多癌基 因的高表达，原癌基因及肿瘤相关基 因的激活都与肿瘤细胞发生密切相 关．抑制此类基因的表达，封闭肿瘤 药物抗性基因表达均可达到抑制肿瘤 相关性状和肿瘤发生的目的．
反义核酸的设计
• 很久以来，反义核酸的设计仅仅考虑RNA
的一级结构，例如选取基因的起始密码子、 启动子、翻译起始因子结合位置、5′帽端序 列、rRNA核糖体结合位点等，这样的反义 核酸虽然在理论上与靶mRNA序列互补， 但是由于靶点可能位于mRNA分子折叠结 构的内部或刚性部位而寡核苷酸无法接近并 结合，使核酸药物没有作用效应，这样的寡 核苷酸的继续应用效果很有限．
注意事项
严格设立两种对照组
• 同一基因非靶位点(未被筛选的序列)的一
段反义链序列作为组间阴性对照
• 筛选获得的位点反义序列通过人工突变2～
4碱基作为组内阴性对照
小结
• mRNA是研发基因药物的最理想分子靶标，筛选
靶基因mRNA结构靶点是反义核酸、核酶及脱氧 核酶、siRNA等核酸药物研发的关键。一般可用 RNaseH作图法作为初次筛选 • 近年诞生的RNA核酶文库方法和RT-ROL法，受 到了普通分子生物学实验室的欢迎．固定RNA 分子和随机寡核苷酸库液相杂交位点分析法筛选 mRNA结构靶位点更为快速、简便，运用于许多 基因的功能和药物筛选研究，前期结果令人鼓舞
应用一系列设计和合成的寡核苷酸，分别 检测它们和mRNA的结合能力，犹如用脚 步度量某段未知长度路程一样，是一个工 作量大而又漫长的过程，需要设计覆盖整 个基因的一系列寡核苷酸，耗资巨大．由 于凭主观经验设计寡核苷酸，容易错过真 正靶点
• 寡核苷酸文库RNA酶作图法
1998年，Ho开创了核酸文库的应用 原理：将一个随机或半随机的寡核苷酸库 与mRNA进行杂交，然后用RNaseH消化 DNA-RNA杂交分子．对所得到的消化片段 进行分析，定位可接近位点．确定了血管 紧张素 I型受体(AT1)mRNA分子上的可接 近位点，发现每个可接近位点的反义序列 均具有活性 是一个被普遍接受的策略
• 1977年Paterson等首先在无细胞体
系中用单链DNA与基因RNA互补结合 抑制基因转录．随后Stephenson使 用13个核苷酸的单链DNA反义抑制肉 瘤病毒Rous sarcoma virus的复制， 开创了抑制基因表达的基因药物研究 方向．
基因为靶的药物研发的3种手段
• 同源重组基因剔除(knock-out) • 与DNA或RNA作用的合成寡核苷酸 • 和DNA或RNA结合的其它分子