生物技术药物-反义核酸与核酶
反义核酸与核酶
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
核酸药物及制药技术
靶向Livin反义核 酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡并提高其对卡铂.doc
RNA干扰药物
RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广泛存 在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。 RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段： Ⅰ启动阶段 Ⅱ执行阶段
siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌
正义链 反义链 混合 Dicer酶加工
体外转录
体T7、SP6等启动子的表达质粒 双链RNA siRNA
siRNA的设计和制备
siRNA的设计 应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细 胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基 因的序列设计siRNA
核酶（Ribozyme)
核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年 Cech在嗜热四膜虫中首先发现。
目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种 1. 发卡状核酶
2.
3. 4. 5.
锤头状核酶
Ⅰ型内含子核酶 RNaseP核酶 丁型肝炎病毒核酶
天然锤头状核酶示意图
5′ 3′ 底物位点 G U U CCUGUCACCGGA G GGACA UGGCCU U U U A CU G A A G AG U C G 催化活性位点 A U G C G C A G UU
RNAi的作用原理
启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一 种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成2123bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合 体，构成“RNA诱导的沉默小体” （RNA-induced silencing complex，RISC） 执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时， RISC就 会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目 标基因的表达
核酶的发现与应用
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
生物技术制药重点总结
1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。
2.生物技术药物：采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。
3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。
分三种构型：共价闭合环状DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。
在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。
5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性的扩增DNA。
在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。
6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。
cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。
7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。
②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。
第16章 反义核酸类药物
第一个反义药物——福米韦生
5 适应证和禁忌证
福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效 果或有禁忌的病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗 的病人，以免增加发生眼内炎的危险性 6 与治疗CMV视网膜炎的其他药物比较
更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；具有交 叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术 以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限 福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而 轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法
硫代磷酸化修饰
主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
第一个反义药物——福米韦生
1 药ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ学
1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活
抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据
核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的
一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
ASGP-PL-反义RNA复合物 → 肝细胞表面ASGP受体识别→ 吞噬 → 释放 → 发挥作用
优点：专一性强，抗降解能力强
反义核酸药物
Replication of the ColE1 Plasmid
• ColE1 replication is unidirectional
ColE1 (6646 bp)
Replicon
RNAI
Origin RNAII
Colicin
2、在转录水平上：
反义RNA可与mRNA 5’-端互补,从而阻止了RNA的完 整转录。 ➢ 大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种 小分子反义RNA的制约。这种反义RNA可与CRP基因转 录起始生成的mRAN分子的5’-端序列互补，形成特异的 二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄-环结构， 空间构象障碍迫使RNA聚合酶脱离DNA模板，停止转录。
?另外在核酶基础上人们又提出了反义核酶的概念即通过基因连接将反义rna与核酶的基因连为一体即通过基因连接将反义rna与核酶的基因连为一体再转录得到具有双重功能的一类rna分子再转录得到具有双重功能的一类rna分子对靶基因既有封闭作用对靶基因既有封闭作用又有切割作用
反义核酸药物
一、概述
1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来 特异性地抑制基因表达的设想。
但由于PS-ODN其本身带有大量的负电荷，能与 多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂 量依赖的毒副作用。
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′ 连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别 磷酸二酯键。
➢α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。 ➢1’位取代、2’位取代: 指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。 如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后,也使asＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
分子生物学---名词解释
一、名词解释1、基因：能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。
2、基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。
3、端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。
该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。
4、操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。
5、顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。
包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。
6、反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。
7、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。
8、增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。
它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。
9、基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。
10、信息分子：调节细胞生命活动的化学物质。
其中由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。
11、受体：是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。
12、分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
13、蛋白激酶：是指能够将磷酸集团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。
14、蛋白磷酸酶：是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。
反义核酸药物剖析
二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄 - 环结构，
空间构象障碍迫使 RNA 聚合酶脱离 DNA 模板，停止转录。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译； 2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始； 3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的
导入方法
1、RNA病毒感染;
2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外 ,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加 as
ＯＮ到达靶细胞的能力。
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
浅谈核酸药物
PCR技术的应用，使得Aptamer的研究近年来有了长足的进步，筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Apta-mer)。
这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA等多种形式的寡聚核苷酸，其配体的性质各异。
用于抗病毒的aptamer多为RNA分子，与基因表达调控有关的重要病毒蛋有什么不妥。
但对白就不行了，人说话的声音受情绪控制的，拍摄时表演的情绪在后期很难模仿到一模一样，就算能模仿，那等于让演员重演一边，而且还要花时间、花场地、花设备。
所以我们看电影拍摄花絮中的场景，拍摄的时候，只有一个专门录对白的话筒。
而其他的声音，可以在后期再录，或直接从音源库里找，然后根据画面进行“配音”就可以了。
3后期编辑电脑配置专业用于后期编辑的系统是计算机技术和数字电视技术相结合的产物，它主要有三部分组成：音频处理卡（即声卡）、视频处理卡（包括视频采集卡和视频压缩卡）以及编辑软件。
用来视频编辑的电脑，最大的区别就是是否有采编卡。
业余领域多半是无卡编辑，通过1394接口或者USB接口把摄像带的内容传输到电脑硬盘中，生成为A VI文件，然后用计算机软件对视频进行后期编辑制作，生成一个新的A VI文件，最后再将视频用专用的压缩软件将编辑好的A VI文件压缩成为MPEG1或MPEG2文件，刻为VCD或DVD永久保存。
任何后期编辑的工作流程，都可以简单地看成输入、编辑、输出这样三个步骤。
当然，由于不同软件功能的差异，其使用流程还可以进一步细化。
一般来说，素材的采集与输入采集主要是利用Premiere Pro软件,将模拟视频、音频信号转换成数字信号存储到计算机中，或者将外部的数字视频存储到计算机中，成为可以处理的素材。
4剪辑软件的横向比较在后期编辑上，目前主要采取无非线性编辑系统，非线性编辑系统是建立在计算机平台上的视频编辑应用系统。
它是集合传统的线性编辑系统里的全部设备为一体的编辑系统。
随着计算机软件方面的逐步发展，“无卡非线性编辑系统”问世，无卡非线性编辑系统造价低廉，它弥补了非线性编辑卡价格昂贵的缺陷，成为DV影片后期编辑的首选。
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调控细胞生长，增殖与分化 正常情况下，表达受严格控制 一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信
号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌
治疗方法
根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA 相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标mRNA作用
以第二种为主来介绍
反义核酸的种类
反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散 的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达
反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序 列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）
反义RNA的临床作用
抗病毒： 将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA
表达载体 再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义
RNA 从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流
感病毒、人类免疫缺陷病毒） 抗肿瘤： 设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及
二、核酶技术及其应用
反义核酸和反义技术概念 反义核酸的基本原理 反义核酸的种类 反义核酸与反义技术的应用
核酶概述 核酶与RNA修复 核酶技术在临床上的应用 核酶技术面临的问题
反义核酸和反义技术
反义核酸(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而 在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设 计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点
AS-TAT) ，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用 由于LTR启动子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的细胞中得以高表达 将这种外源基因导入Molt-3 T细胞系、CEM-SS T细胞系及健康人外周血单
个核细胞(PBMCs)，对实验及临床分离病毒株均有抑制作用 gag是HIV-1的结构基因，编码p24等病毒结构蛋白 Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于gag区不同长度的反义
GEM 92 HGTV43
Company
AVI BioPharma Corgentech
ISIS Pharma ISIS Pharma AVI BIoPharma
EpiGenesis
AVI BioPharma
ISIS Pharma Ribozyme Pharma Ribozyme Pharma Pantheco AVI Biopharma
其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNase H使
mRNA易被核酸酶降解 作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成
熟 作用于PoIy A形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运
反义RNA的作用机制
m7G5'ppp rRNA
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
互ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ RNA
c-myc
C-MYC
反义RNA的作用机制
作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接 反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻
止特定基因的转录 互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及
某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA 以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的
反义DNA与靶基因结合形式
寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性
寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物， 激活RNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNA
Status / Remarks PIII (Affinitak) PIII
PIII
针对其他疾病的反义药物
Oligo
Resten NG E2F Decoy
ISIS 2302 ISIS 104838 AVI 4014
Durason
AVI 4126
ISIS 14803 HEPTAZYME HepBzyme PNAbiotics NeuBiotics
GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY
ANTISENSE TECHNOLOGIES
MOLECULAR DIAGNOSTICS
DRUG DELIVERY SYSTEMS
GENE THERAPY
反义RNA的应用（一）
利用反义RNA的原癌基因失活疗法：
阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA成熟
Hybridon Enzo
Indications Cardiovascular disorder Autoimmune & Inflammatory Respiratory disorder Urological Disease
Infectious Disease
AIDS & Related disease
第一个反义药物——福米韦生
1 药效学 1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活 抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用 1.2 抗病毒活性 对人类CMV病毒株AD169的EC50为0.37μmoL 此EC50为更昔洛韦（ganciclovir）的l30～190 1.3 耐药性 耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变， 这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的
RNase H ASODN mRNA
TFO
反义寡聚核苷酸与 mRNA特异性结合， 阻断翻译过程
反义技术与反义核酸的应用
Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry
PHARMACEUTICALS
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
第一个反义药物——福米韦生
Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批准上市的第1个反义药物 商品名Vitravene 美国ISIS Pharma公司研制 瑞士Ciba Vision Ophthalmics公司申请 1998年8月在美国首次上市 核苷酸序列为5’- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’ 硫代磷酸化修饰 主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
RNA(225-1225nt) 在CEM-SS T细胞及外周血CD4细胞均有抑制HIV-l复制的作用 长片段反义RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能与不同种的HIV-l RNA结
合而限制了病毒的逃逸
部分反义药物
针对肿瘤的反义药物
Oligo
ISIS 3521 ISIS 2503 ISIS 5132 AP12009 Oncomyg NG AVI 4557 Genasense GEM 231 GTI 2040 GTI 2501 LEafAON PAN 346 HERZYME ANGIOZYME
点结合成RNA/RNA双链体 双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译
反义RNA的应用（二）
反义RNA的应用（二）
反义RNA的应用（二）
抗HIV-l的作用 ：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而 实现抗病毒作用
tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat蛋白 在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-
第一个反义药物——福米韦生
2 药动学 2.1 兔体内药动学 以14C标记的福米韦生单次66μg剂量，玻璃体液中消除t1/2为62h 给药10天后，仍对CMV复制有抑制作用，有22%的福米韦生存在，其