生物技术药物-反义核酸与核酶

第一个反义药物——福米韦生
1 药效学 1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活 抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用 1.2 抗病毒活性 对人类CMV病毒株AD169的EC50为0.37μmoL 此EC50为更昔洛韦（ganciclovir）的l30～190 1.3 耐药性 耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变， 这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的
RNA(225-1225nt) 在CEM-SS T细胞及外周血CD4细胞均有抑制HIV-l复制的作用 长片段反义RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能与不同种的HIV-l RNA结
合而限制了病毒的逃逸
部分反义药物
针对肿瘤的反义药物
Oligo
ISIS 3521 ISIS 2503 ISIS 5132 AP12009 Oncomyg NG AVI 4557 Genasense GEM 231 GTI 2040 GTI 2501 LEafAON PAN 346 HERZYME ANGIOZYME
第一个反义药物——福米韦生
Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批准上市的第1个反义药物 商品名Vitravene 美国ISIS Pharma公司研制 瑞士Ciba Vision Ophthalmics公司申请 1998年8月在美国首次上市 核苷酸序列为5’- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’ 硫代磷酸化修饰 主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标mRNA作用
以第二种为主来介绍
反义核酸的种类
反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散 的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达
反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序 列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）
点结合成RNA/RNA双链体 双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译
反义RNA的应用（二）
反义RNA的应用（二）
反义RNA的应用（二）
抗HIV-l的作用 ：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而 实现抗病毒作用
tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat蛋白 在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
互补 RNA
c-myc
C-MYC
反义RNA的作用机制
作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接 反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻
止特定基因的转录 互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及
某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA 以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的
反义DNA与靶基因结合形式
寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性
寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物， 激活RNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNA
AS-TAT) ，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用 由于LTR启动子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的细胞中得以高表达 将这种外源基因导入Molt-3 T细胞系、CEM-SS T细胞系及健康人外周血单
个核细胞(PBMCs)，对实验及临床分离病毒株均有抑制作用 gag是HIV-1的结构基因，编码p24等病毒结构蛋白 Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于gag区不同长度的反义
Hybridon Enzo
Indications Cardiovascular disorder Autoimmune & Inflammatory Respiratory disorder Urological Disease
Infectious Disease
AIDS & Related disease
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
RNase H ASODN mRNA
TFO
反义寡聚核苷酸与 mRNA特异性结合， 阻断翻译过程
反义技术与反义核酸的应用
Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry
PHARMACEUTICALS
物累积现象 但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象 福米韦生115μg单次给药，在视网膜中消除t1/2为78h
第一个反义药物——福米韦生
3 临床疗效 前3周每周福米韦生165μg玻璃体内注射，以后每2周给药1次，用药组
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
反义RNA的临床作用
抗病毒： 将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA
表达载体 再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义
RNA 从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流
感病毒、人类免疫缺陷病毒） 抗肿瘤： 设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及
在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为 反义链
精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7到30个核苷酸组 成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内， 干扰特定基因表达
利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、 mRNA及蛋白水 平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
Company
ISIS Pharma ISIS Pharma ISIS Pharma Antisense Pharma AVI BIoPharma AVI BIoPharma Genta Hybridon Lorus Therapeutics Lorus Therapeutics NeoPharm Panacea Pharma Ribozyme Pharma Ribozyme Pharma
GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY
ANTISENSE TECHNOLOGIES
MOLECULAR DIAGNOSTICS
DRUG DELIVERY SYSTEMS
GENE THERAPY
反义RNA的应用（一）
利用反义RNA的原癌基因失活疗法：
阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA成熟
GEM 92 HGTV43
Company
AVI BioPharma Corgentech
ISIS Pharma ISIS Pharma AVI BIoPharma
EpiGenesis
AVI BioPharma
ISIS Pharma Ribozyme Pharma Ribozyme Pharma Pantheco AVI Biopharma
生物技术药物
朱俊铭
2011年10月
主要内容
绪论 动植物细胞培养生产医药用产品或原料 转基因动植物作为药物生物反应器 抗体工程药物 干细胞与治疗性克隆 基因工程疫苗与DNA疫苗 基因药物 反义核酸与反义技术 生物技术药物新药与专利申报 生物技术制药产业化个案
反义药物
主要内容
一、反义核酸与反义技术
二、核酶技术及其应用
反义核酸和反义技术概念 反义核酸的基本原理 反义核酸的种类 反义核酸与反义技术的应用
核wenku.baidu.com概述 核酶与RNA修复 核酶技术在临床上的应用 核酶技术面临的问题
反义核酸和反义技术
反义核酸(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而 在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设 计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点
Status / Remarks PIII (Affinitak) PIII
PIII
针对其他疾病的反义药物
Oligo
Resten NG E2F Decoy
ISIS 2302 ISIS 104838 AVI 4014
Durason
AVI 4126
ISIS 14803 HEPTAZYME HepBzyme PNAbiotics NeuBiotics
其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNase H使
mRNA易被核酸酶降解 作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成
熟 作用于PoIy A形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运
反义RNA的作用机制
m7G5'ppp rRNA
第一个反义药物——福米韦生
2 药动学 2.1 兔体内药动学 以14C标记的福米韦生单次66μg剂量，玻璃体液中消除t1/2为62h 给药10天后，仍对CMV复制有抑制作用，有22%的福米韦生存在，其
余78%则降解为短链代谢物 视网膜中消除t1/2约为79h 2.2 猴体内药动学 玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系 峰值浓度出现在给药2～3天后，14天后基本检测不到 在每周或每2周玻璃体内注入11、57和115μg后，玻璃体液中未发现药
原癌基因
调控细胞生长，增殖与分化 正常情况下，表达受严格控制 一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信
号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌
治疗方法
根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA 相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位