多糖结构解析

C H 3
C H O H
O H
以1→2位键合(1→2,6类似)
C H O H 2 CH OH H 2 I O H 4 O N a B H + 4 O H O HH CHOH 2 CHO C H O H H O H O 2 2 0 OHC O O H O H C 2 CH OH H O H O 2 O
O
CH OH 2
O H
CH OH 2
C H O H 2
CH OH 2
以1→4位键合(1→4,6类似)
O I H O 4 O N a B H + CHOH CH O 4 H O H 2 O H H CH OH 2 + O H O CH O 0 2 2 O HOHC O O OHC OHC O H O H C 2 H O H CH OH 2
3、甲基化（单糖残基的连接方式） 是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基甲基 化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖产物，就 可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置（羟 基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点）。 （氢化钠、碘甲烷） （1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于100ml试 剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入1.5gNaH，渐 渐加温，然后恒温在65-70℃4-6小时。最终颜色 为墨绿色。整个过程通氮，并搅拌。
碱降解反应 碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端的 单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分析多糖碱降 解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分 子的非还原端。 过碘酸及其盐的氧化反应 多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似，其与 过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例 之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二元醇相似，其 开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的 （1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧 化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可 确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
O
（水解、还原）
OC H 3
O H 3O C H 3 O O H H C 3 H O C H 3
OC H 3 O H H O C 3 H C 3 O C H 3
O C H 3 O H H O H O H OC H 3
+n
O H H
+1
O H H
(2,3,4,6-O-四甲基Glc)
(2,3,6- O-三甲基Glc)
（7）水解、还原和乙酰化 ①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸1ml， 充N2 封管，100℃水解4小时，然后加甲醇蒸除甲酸，至 pH为67，真空干燥，再加入2 mol/L 三氟乙酸2ml， 100℃水解6小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中 性，再用蒸馏水赶除乙醇。 ②还原。加入NaBH4 60mg还原24小时，室温磁力搅拌；然 后加入半匙阳离子交换树脂，磁力搅拌2小时，定量滤纸 过滤，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥; ③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙酰化 2小时，然后移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶除乙酐， 然后真空干燥; (8)样品分析。产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行GC分析 及GCMS分析。
(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结构分 析） 1、官能团的定性及定量 2、测定并解析化合物的有关光谱 （UV,IR,MS,HNMR,CNMR等） (4) 推断并确定分子的平面结构 1、 结合文献调研 2 、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。 (5)推断并确定分子的主体结构 1、测定CD或ORD谱 2、测定NOE,NOESY或ZD-NMR谱 3、进行X射线晶体衍射分析或人工合成
O H
1→、1→6键型
2 CH OH H 2 2 I O CH OH H 4 O N a B H 2 + 4 O H O HH CHOH + CHO C H O H H O 2 H O CH OH 2 2 0 O O + OHC CH OH H O H C H O H 2 2 H C O O H
O
多糖结构测定的意义
从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即 使具有很强的活性与具有较大的安全性，但如果 结构不清楚，则无法进一步开展其药理学与毒理 学研究，也就不可能进行人工合成或结构修饰改 造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究， 其学术及应用价值将会大大降低。
结构研究的主要程序
(1)初步推断化合物类型 1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。 2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的溶解 度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。 3 结合文献调研。 (2)测定分子式,计算不饱和度 1、元素定量分析 2、分子量测定 3、同位素峰法 4 、HI – MS等
（3）透析 产物加蒸馏水稀释一倍，蒸馏水透析2-3天（换水） （4）真空干燥（或冻干），得部分甲基化多糖，需进一步 甲基化 （5）进一步甲基化： 重复1-4的Hakomori methods 氧化银法 （6）产物：甲基化产物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿层， 干燥得甲基化糖。 甲基化产物分析 气相色谱法。
（碘甲烷） 以(1→4)葡聚糖为例: （甲基化） O H
（甲醚甲基化糖）
O H O
O H O O H OH O H O H H O H O H O H H H O H H O H O H H O H O H
4
O H H O H H H O H O H
O
Βιβλιοθήκη BaiduH O H
H O
H H
H
O H
n
O
O
H C 3
(2,3,6- O-三甲基Glc)
O H O H
COCH3 CH3 117 161 CH3 CH3
(1)各种单糖甲基化衍生物的基峰均为43， 为CH3CO+ ; (2)被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有 甲氧基的碳原子容易与相邻碳原子间发生断键，形成 正离子。
205
CH3 O H H
161
O
205
1、过（高）碘酸氧化 原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成 相应的多糖醛、甲醛或甲酸。 结果： 1 2 或1 4键：每个糖基仅消耗一个分子的高碘 酸，无甲酸释放。 1 3位键：不被高碘酸氧化 1 6位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一个分 子甲酸。 然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。 防止发生超氧化：控制pH3-5；避光；空白对照实验
O OCH3
45
断裂方式如下: 主要碎片(m/e)为：45.117.161.205
OCH 3 COCH 3 OCH 3
甲 醇
OCH 3
O COCH 3 H C m 2 / e 1 2 9 OCH 3 OCH 3
乙 烯 酮
H C 2
OCH 3 O H
m / e 8 7
OCH 3
乙 醇
甲 醛
C H 2
m / e 1 6 1
二、糖与蛋白之间连接键型分析 β-消除反应 原理：糖温和条件下稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸 的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来。与 天冬酰胺相连的N-型连键则不能被稀碱水解下来。所 以，β-消除反应在糖蛋白的结构分析中，常被用来区别 糖链的连接性质。 方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在60℃ 水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比，在230270nm范围内扫描。 结果判断：在270nm处无明显吸收峰增加，提示：糖与蛋 白之间的连接键属非O-型糖苷键。
多糖（Polysaccharide）是天然大分子物质， 是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分析较 蛋白质结构分析复杂，一方面是因为组成多糖的 单糖品种繁多（目前已知的单糖有200多种）； 另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连接方 式的不同以及可能有分枝（蛋白质没有分枝）， 所以多糖的结构种类就很多，不容易分析。
m / e 1 0 1
OCH 3 OCH 3 O COCH 3
m / e 7 1
由161、205进一步裂解为71.87.101.129.145。
-乙醇
OCH 3 OCH 3 OCH 3
一、组成成分分析
1、酸水解 1-3N硫酸，100 ℃，水解6-8小时。用碳酸钡 中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。 气相色谱分析 纸层析（PG）： 展开剂： 正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5； 正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3 显色剂：常用硝酸银显色剂 A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V） B：1%NaOH乙醇溶液（W/V） C：6 mol/L氢氧化铵
O H O O C H 3 O H OC H 3
C H 3
O C H 3 O H H O C 3 O H O C H 3
O H H O H C 3 O H H O C 3 C H 3 O H O O O H O C H 3 O C H 3 C H 3 C H 3 C H 3 OH
n
O C H 3 C H 3 H
1
O
O
+ H C SC H C SC H H N a 3 3 3 NaOH 2
+
（二甲基亚砜）
（二甲基亚砜磺酰阴离子）
O
2 3
O
- + - + H C S C H N aR OHR 3 O N aH 2 C S C H
+
+ 3
3
（糖）
- + O N a I H C R + 3
（糖羟基-醇钠）
R N a I O C H + 3
①喷试剂A，室温风干；②将纸浸入B液中，待斑点显色；③再浸 入C中以洗去滤纸上的氧化银；④水冲洗1小时左右，风干，显棕黑 色斑点。
2 、乙酰解 冰醋酸溶液加入少许硫酸进行 乙酰解，可以生成乙酰化单糖通过气相色 谱鉴定。 原因：因为1-6糖苷键多糖对酸水解相对 稳定一些，但在乙酰解中则优先断裂，有 利于结构的研究。 3、碱降解 4、酶解
以1→3位键合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4类似)
O H O H H O HH 0 O H O H
I O 4
O H N a B H 4 O H H H H H H O O 2 H O O H H O H
+ H
2、Smith降解：是将氧化产物还原后进行酸水解。 1 2位和1 6位键结合的经Smith降解后都有甘油产生。 （但1 2位结合的不产生甲酸，可供以区别）。 1 4键合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤藓 醇）。 1 6键合的，最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。 1 4键合的戊糖聚糖，相应的产物是乙烯二醇和甘油。 操作：高碘酸氧化：多糖液加入一定量的 15-20mmol/L 高碘酸钠溶液。 黑暗搅拌反应，定时取样在 222nm 测定光密度值， 直到光密度值下降到稳定为止（不再下降）。
（2）多糖甲基化 精确称取纯多糖200mg，加35ml无水二甲亚砜， 通氮下搅拌至完全溶解后，加入18-20ml制备的 负碳离子液，通氮下搅拌4-6小时，然后加入8ml 碘甲烷，通氮条件下搅拌1-2小时后，停止通 氮，继续搅拌过夜。 注：糖液加入负碳离子后，液渐变为橙黄色；加碘 甲烷后液由混浊变清彻。
（1）高碘酸消耗量：用0.01mol/L标准碘液滴定高碘酸 消耗量 （2）甲酸成： 将样品溶液加少量乙二醇，放置10分钟 后（以中止反应还原剩余的高碘酸），然后用0.01mol/L 氢氧化钠滴定甲酸的释放量。 （3）降解：上述反应物加入1ml乙二醇、对蒸馏水透析 24小时。减压浓缩至小体积，加硼氢化钠还原。 用2 N 硫酸水解（100℃，6hr），碳酸钡中和 纸层析（需标样）、薄层色谱层析、气相层析
三、结构研究的化学方法
完全酸水解 阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常用 的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和 糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α型较 β型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷键一般 较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液，然后用层析方法分析， 常用的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这 种酸水解方法分析已经达到完全自动化。 部分酸水解 控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较低 分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。 其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压 液相层析。解析寡糖结构较多糖简便的多，但需减少回复现象，水 解时多糖的浓度小于5%。