烟草组培苗实验步骤
实验二 无菌苗的培养
实验二无菌苗的培养一、实验目的学习外植体的灭菌与接种方法，熟悉无菌操作技术，为下一次实验培养无菌苗。
二、实验内容外植体的灭菌与接种：分4组，合做1份，每人接种1瓶。
三、实验用品1. 仪器与器皿：超净工作台4台，光照培养箱；灭菌的100ml烧杯或三角瓶10个、长镊子10把、培养皿10套、吸水纸条4份、牙签若干、无菌1.5ml离心管若干；酒精灯6-8个、废液缸6-8个。
2. 材料与试剂：去皮甜瓜籽仁250粒，或烟草种子若干，75%乙醇，1%氯化汞溶液300ml，MS基本培养基32瓶，灭菌蒸馏水8-10份（每份200ml），75%乙醇。
四、实验方法1、实验前的准备：将酒精灯、废液缸和镊子等用具置于超净工作台中，打开风机，再开紫外灯照射25min，然后关闭紫外灯，开大风机。
2、实验操作：在自来水管下将手洗净，再用酒精棉（75%乙醇浸泡）擦拭双手，然后进入超净台进行如下操作；1）点燃酒精灯；2）将甜瓜籽或烟草种子置于小烧杯中，加入0.1or1%氯化汞（或次氯酸钠）溶液20~25ml，不时摇动灭菌约10/8min；（如为烟草，则所有操作均在1.5ml离心管内完成，所加试剂量0.5~1ml）3）用灭菌水漂洗5次，最后用吸水纸吸干水分，用镊子夹取接种在MS培养基上，每瓶接种5-10粒；（如为烟草，则用牙签沾取种子接种在培养基上。
）4）用封口膜封口，在三角瓶壁上标好姓名和日期，置于25℃、光照条件下培养。
以上所有操作尽量在酒精灯前进行。
五、观察记录2~3天后开始观察培养物的萌发与污染情况。
六、实验报告：每人一份。
1. 实验目的2. 实验方法3. 实验结果与分析3.1 用流程图表示甜瓜（或烟草）无菌苗的培养过程。
3.2 统计成苗率与污染率，分析引起污染的原因。
实验十七(2)烟草原生质体融合
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
5
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
6
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
5min内缓慢
加入5ml W5 稀释液，轻
轻吸打混匀
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
静置 >30min
7
（5）融合原生质体的观察
吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数 板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融 合率。 融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合 融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数
8
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
普生实验报告烟草幼苗培养
普生实验报告
实验名称烟草幼苗的组织培养
实验目的：
1.掌握植物组织培养中无菌操作技术。
2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。
记录一：周次：14
6-BA:NAA=1:5 2-4D
6-BA:NAA=5:1 对照组
记录二：周次：15
6-BA:NAA=1:5 2-4D
6-BA:NAA=5:1 对照组
记录三：周次：16
6-BA:NAA=1:5 2-4D
6-BA:NAA=5:1 对照组
作用：6-BA ：促进芽的形成,诱导愈伤组织发生。
NAA ：促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。
差异：培养基中生长素、细胞分裂素浓度不同，可以诱导烟草幼片生根或生芽。
细胞的全能性：植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化的细胞发生脱分化，成为重新具有分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。
实训三 烟草苗情观察
实训三烟草苗情观察
一、实训目的
通过观察烟草幼苗长势长相，了解其生长规律，分辨苗期各个生育期，为今后到工作烟草站育苗打下基础。
二、实训场地
教室。
三、实训形式
以个人为单位进行观察。
四、实训材料用具
腐叶土、营养钵、云烟87种子、水、铅笔、记载表等。
五、实训内容
营养钵装一半腐叶土，并播2-3粒云烟87种子，盖土不见种子，浇足水，每天观察1次，并填写观察记载表。
六、作业
1、管理好营养钵培育烟苗
2、烟苗观察记载
①烟苗观察记载表
②烟苗生育期观察记载表。
烟草培养方法以及转基因方法
烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
烟草幼苗的组织培养
烟草幼苗的组织培养
一、目的与要求
掌握植物组织培养中无菌操作技术 学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法
二、 实验原理
植物组织培养 在无菌条件下，将植物体的一部分细胞、组织、器 官切割下来，接种到营养介质上，使其增殖成一群细胞、组织、器官， 甚至完整植物体的实验技术。
植物细胞全能性 植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适
当条件下具有繁殖出完整植株的能力。 脱分化 已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性 细胞的过程。 再分化 经过退分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细 胞、组织、器官或完整植物体。 改变生长素NAA和细胞分裂素6-BA浓度比例，可以决定烟草幼苗从 叶片直接分化生成根或芽。 2，4-D能够诱导生成愈伤组织。
1% 1% 1% 3%
3个实验组 5.8 0.8%
Step1: 配大瓶培养基(无激素)
500 ml
Step 2: 分瓶,加激素, 调PH=5.8
125ml
ctrl
NAA:6-BA=1:5
NAA:6-BA=5:1 2,4-D
Step 3:分装,加琼脂
30ml
四、操作步骤
1.灭菌：
(1)器具灭菌： 剪、镊、培养皿，诱导培养基， 120℃，高压灭菌15-20min；
五、无菌操作注意事项
1.
2.
无菌操作时不要讲话，以免污染；
用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒 精灯火焰，以免火焰伤手。
烟草幼苗的组织培养实验报告
烟草幼苗的组织培养实验报告一，实验名称：烟草幼苗的组织培养二，实验原理：植物组织培养是指在无菌条件下，分离并在培养基中培养立体植物组织（器官和细胞）的技术。
植物组织培养的理论基础是植物细胞具有全能型。
植物组织当中原本已经分化的细胞，在脱离原有机体环境成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化的细胞发生脱分化，成为重新具有分裂能力的细胞（本实验中用到的是愈伤组织，是由植物的一个离体的细胞，一块组织或一个器官的细胞脱分化形成的），并重新生长发育成完整的植株。
生长素，细胞分裂素浓度之间的平衡可以决定烟草组织幼苗的叶片或茎髓将产生根，茎或仅仅是愈伤组织。
三，实验材料和用具：1、材料：烟草幼茎2、用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术器械、20ml量筒、PH试纸、烧杯、玻璃棒、三角烧瓶、封口膜、高压橡皮筋。
3、试剂：MS培养基、NAA、6-BA四，实验步骤：1、培养基的配置成分实际称取量大量元素（10×）40 ml蒸馏水300 ml微量元素（100×） 4 ml有机成分（100×） 4 ml铁盐（100×） 4 ml蔗糖12 g定容至400 ml激素（1 mg/ml）每130 ml MS加：生根6-BA=13 μl NAA=65 μl生芽6-BA=65 μl NAA=13 μl对照组（不加激素）pH值 5.8分瓶30 ml/瓶琼脂0.24 g2、培养基、剪子、镊子、枪头需在高压灭菌锅120摄氏度灭菌20分钟。
3、接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30分钟4、肥皂洗手和手腕，关闭无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，并关掉超净工作台上的紫外灯。
再用百分之七十的酒精喷手。
5、点燃酒精灯6、将橡皮筋解开（不掀开封口膜），放到无菌风道侧面。
将镊子见到放到酒精灯外焰灼烧，冷却后剪取外肢体。
迅速用另一手持三角瓶，去下封口膜，瓶口略倾斜，在酒精灯外焰上灼烧数秒。
烟草的组织培养与植株再生
烟草的组织培养与植株再生作者：梁程李一鹏来源：《读天下》2017年第10期摘要：在MS培养基上，接种烟草无菌苗的叶片，分别放在光照和黑暗条件下诱导愈伤组织，接种于MS分化培养基上，在光照下分化再生植株。
结果表明：光照和植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再生产生影响。
关键词：烟草；愈伤组织；植株再生一、实验目的1. 掌握植物组织培养的方法和要点。
2. 学习培养基配制方法、步骤及叶片培养环节中，外植体灭菌、接种、培养观察等技术环节。
3. 了解外植体脱分化及再生过程。
二、材料与器材1. 植物材料：烟草叶片。
2. 实验药品：MS培养基、蔗糖、琼脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。
3. 仪器设备：高压灭菌锅、光照培养箱、天平、pH计、超经工作台、酒精灯。
4. 器械及用具：镊子、手术刀、记号笔等。
5. 玻璃器皿：培养瓶、量筒、容量瓶等。
三、实验步骤（一） MS培养基母液配制大量元素配成50倍母液，使用时每1L培养基需要从母液中取20mL。
配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。
微量元素配成100倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10mL，配制时应注意充分溶解后再依次混合。
铁盐单独配制，与其他元素混合易造成沉淀。
一般采用螯合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大100倍。
EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75℃～80℃之间让其螯合1h。
使用螯合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe2+。
有机物质可配成100倍浓缩液，使用时每1L培养基加10mL。
（本次实验采用培养基粉末代替较为方便）（二）培养基的配制取1000mL烧杯，先加入500mL的蒸馏水，然后根据培养基成分及用量，吸取各种母液加入烧杯，称取蔗糖（一般用量3%）、琼脂（一般6～8g/L），按需要的浓度加入植物激素，加水至800mL，加热使琼脂融化，定容到1000mL，用1NNaOH或HCl调pH至5.8。
作业：设计烟草叶片组织培养培养基讲义
每班分为6组，根据实验目的，每组设计一种烟草 叶片组织培养培养基。 第一、二组：诱导烟草叶片产生芽 第三、四组：诱导烟草叶片产生根 第五、六组：诱导烟草叶片产生愈伤组织 要求在MS （或1/2 MS ）基本培养基的基础上附加 合适种类和浓度的生长素和细胞分裂素激素，以 实现实验目的。即： MS+ （？mg/L）+ （？mg/L）+蔗糖（3%）+ 琼脂粉（0.36%）pH5.8 通过查阅相关资料，提出合理的培养基配方。
参考资料
/index.htm
李友勇，李秀菊.应用生物技术.北京：中国农业科技出
版社 刘卫群等.烟草K326叶片愈伤组织诱导及继代的初步研 究[
组培实验报告——烟草的再生
植物组织培养题目：烟草的再生姓名：专业班级：学号：指导老师：2012年10月13日烟草的再生前言植物组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。
细胞全能性是指植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
细胞全能性是植物组织培养的理论基础。
一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。
脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。
植物组织培养的过程：植物组织培养的类型，按材料分为：愈伤组织培养、器官培养（胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养）、细胞培养（悬浮细胞培养和单细胞培养）、原生质体培养。
本次实验采用的就是器官培养，以烟草叶作为培养材料。
植物组织培养可以分为初代培养和继代培养。
初代培养是指外植体的最初培养。
继代培养是将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，成为继代培养。
植物组织培养的特点：1、培养条件可以人为控制。
2、生长周期短，繁殖率高。
3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。
故植物组织培养具有良好的前景，可用于快速繁殖、种苗脱毒、远缘杂交、突变育种、单倍体育种等。
一、实验目的1、了解掌握组织培养的基本概念和基本原理。
2、了解开展组织培养工作的基本设施。
3、了解无菌操作和组织培养的操作技术。
二、实验原理植物体细胞具有细胞全能性。
细胞一旦脱离了母体植株，拜托了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。
烟草组织培养实验方案
烟草组织培养实验方案摘要本实验通过配制四种培养基来实现烟草种子萌发，种子苗叶片诱导、分化及植株再生，从而获得课题所需要的基因受体植株。
关键词烟草组织培养前言组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。
烟草是典型的基因工程模式植物,易于进行组织培养,容易得到再生的转化植株。
一实验植物：华烟6号二实验材料：华烟6号种子三实验方法与步骤1．培养基的配制本次实验使用（1）种子萌发培养基：MS培养基+GA30.7mg/L；（2）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（3）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（4）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。
上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2 000 lx。
2. 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）3. 无菌苗的获得把烟草种子用市售丝袜（或纱布）包好，先分别用75%乙醇或无菌水浸泡30 s，用无菌水洗净表面抑制种子萌发的药物，待洗涤的水清澈透明，然后将烟草种子用70%酒精浸泡1 min, 10%NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后，在超净工作台处（紫外灭菌20～30min）接种于以配置好的（1）培养基,放入(27±1)℃的光照培养架中培养。
光照周期为10 h(8:00~18:00)光照,12 h暗培养。
种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。
4. 烟草叶片愈伤诱导及不定芽分化在超净工作台上取上述烟草无菌苗幼嫩叶片1~2片于无菌培养皿中，将叶片切成1.0～1.5平方厘米的小方块，接入（2）中培养。
约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。
30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。
烟草转基因操作细则
烟草转基因操作细则烟草无菌苗准备:将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。
转基因步骤：1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）；2 离心收集菌液；3 用25 mL激活培养基(液)悬浮；4 在28o C摇3-5 h；5 转入到培养皿；6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）；7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方；8 在激活培养基中浸泡10 min 左右；9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液；10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）；11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养；12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。
培养基配方激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8);筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。
注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。
**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。
烟草叶片培养
实验六烟草叶片培养
一、目的要求
1、了解烟草叶片组织培养植株再生的途径。
2、熟练掌握叶片外植体的消毒与接种技术。
二、材料、仪器与试剂
1、材料：带有3-5片以上真叶的烟草实生苗；
2、仪器：超净工作台、培养皿、接种工具、酒精灯等；
3、试剂：固体培养基（MS无机+B5有机+2mg/L 6-BA）、消毒剂、无菌蒸馏水等
三、方法步骤
1、选取大小合适的烟草幼嫩叶片，剪下后放入小烧杯中用清水冲洗去掉叶片表面灰尘，70%酒精处理30s，10%次氯酸钠溶液10min，无菌水冲洗3-5次后，无菌水浸润备用。
2、将一片消毒处理后的烟草叶片放置于培养皿中，用无菌解剖刀切成0.5c m×0.5cm大小左右的碎片，并将其接种至已配制好的无菌固体培养基表面。
3、将接种好的材料放置于25±2℃的培养室中进行培养。
4、观察叶片的生长状况，并记录过程。
四、作业
将本次实验过程写成实验报告，并写出实验观察结果。
烟草栽培学实验指导书
目录实验一烟草形态与类型的观察与识别 (2)实验二育苗技术观察 (5)实验三烤烟烟苗素质考察 (10)实验四主要栽培技术与烤烟生长分析 (11)实验五打顶时期与留叶数对叶片生长的影响观察 (12)实验六烤烟叶片经济性状考察 (13)实验一烟草形态与类型的观察与识别一、目的通过观察烤烟根、茎、叶等器官构造与形态，建立对烟草初步的感性认识；观察掌握不同类型烟草的形态特征并能识别。
二、内容观察烤烟植株形态及根、茎、叶等器官特征，观察烤烟、白肋烟、香料烟、晒烟、晾烟、黄花烟六种类型的外观特征，并能描述。
1、烤烟烤烟亦称火管烤烟，源于美国的弗吉尼亚州，具有特殊的形态特征，因而也被称为弗吉尼亚型。
烤烟的主要特征是植株高大，叶片分布较疏而均匀。
一般株高120-150cm，单株着叶20-30片，叶片厚苤适中，中部的质量最佳。
栽培上不宜施用过多的氮素肥料。
叶片自下而上成熟，分次采收最初的调制方法也是晾晒。
后来（1869）年改用火管烘烤。
目前是在烤房内调制，烤后呈金黄色。
其化学成分的特点是含糖量较高，蛋白质含量较低，烟碱含量中等。
烤烟是我国也是世界上栽培面积最大的烟草类型，是卷烟工业的主要原料，也被供作斗烟。
世界上生产烤烟的国家主要有中国、美国、印度，其次是巴西、津巴布韦、泰国、加拿大、日本等。
我国烤烟种植面积和总产量都居世界第一位。
重点产区有河南、山东、云南、贵州、黑龙江、湖南、湖北、陕西、安徽等省，四川、广东、福建、辽宁、江西、广西、吉林等省（区）也有较大面积的栽培。
2、晒烟晒烟的烟叶利用阳光调制，主要有晒红烟与晒黄烟。
一般晒黄烟外观特征和所含化学成分与烤烟相近，而晒红烟则同烤烟差别较大。
晒红烟的叶片一般较少，叶肉较厚，分次采收或一次采收，晒制后多呈深褐色或褐色，以上部叶片质量最好。
烟叶一般含糖量较低，蛋白质和烟碱含量较高，烟味浓，劲头大。
晒烟主要用于斗烟、水烟和卷烟，也作为雪茄芯叶、束叶和鼻烟、嚼烟的原料。
此外，有些晒烟还可以加工成杀虫剂。
彭勇 烟草组织培养实验报告
烟草组织培养 实验报告单位：华中师大一附中姓名：彭 勇完成时间：2016.10.14烟草组织培养（彭 勇 华中师大一附中）一 实验目的1．熟悉植物组织培养技术的基本原理2．掌握培养基制备、外植体处理、接种、培养观察等技术方法3．理解外植体脱分化及再分化过程二 实验原理植物体细胞具有细胞全能性。
在无菌且光照、温度、营养等培养条件适宜的情况下，离体的植物组织会经过脱分化过程形成愈伤组织，经再分化形成丛芽、生根最终发育成新的幼苗。
三 实验材料、药品及仪器1．实验材料：脱毒烟草幼苗（川布兰公司提供）2．实验药品：70%酒精、超纯水、MS培养基试剂盒等（试剂盒包含MS培养基干粉、pH试纸、激素A/B，川布兰公司提供）3．仪器设备：微波炉、高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、电子天平、pH计、超经工作台、酒精灯等4．器械及用具：镊子、手术剪、酒精灯、记号笔等5．玻璃器皿：培养瓶（川布兰公司提供）、量筒、容量瓶、烧杯、培养皿等四 实验简要过程与操作1．操作间超净工作台的准备将组培室操作间、超净工作台、光照培养箱等打扫清理干净，并用70%酒精对超净工作台等设备进行擦拭消毒，然后将操作间和超净工作台的紫外灯和风机打开，消毒30-60min。
2．培养基的制备按照试剂盒附带说明书称量、溶解培养基干粉并用微波炉煮沸，定容后浓度浓度为42g/L；然后调节pH至6.0。
其中用叶片诱导愈伤组织时，1L培养基需添加激素A 2mL、激素B 20μL；愈伤组织诱导丛芽、根的分化，以及用带芽的茎段直接诱导培养幼苗时，则无需添加激素A和B。
3．培养基的分装将煮沸并定容后的培养基（呈现澄清透明状），冷却至约50℃（不烫手）时分装至培养瓶，每瓶分装约20-30mL，适当拧紧培养瓶盖。
4．器具及培养基的高压蒸汽灭菌将分装好的培养瓶以及用牛皮纸包好的镊子、手术剪、培养皿等一并放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃加热20min；灭菌完成后取出置于消毒好的超净工作台，待其自然冷却，培养基灭菌后在瓶底有少量铁锈色颗粒沉淀。
烟草组培苗实验步骤
烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/LNaOH、1mol/LHCL蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸（5.5-9.0）、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤注意：1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2•2H2O 单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2-2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4-7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签3、铁盐配制将FeSO4•7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中，贴上标签。
4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
烟草根部组织培养及药物分析研究
烟草根部组织培养及药物分析研究烟草是一种广泛种植及使用的作物，其根部组织含有大量有益成分，如挥发油、黄酮类化合物等。
因此，对烟草根部组织的培养及药物分析研究具有重要意义，可以为医药、化妆品及食品等领域的研究提供重要的基础。
一、烟草根部组织培养技术烟草的根部组织可以进行组织培养，即将其分离、培养，以获得大量的细胞或组织材料。
烟草的组织培养技术被广泛应用于植物遗传转化、组织工程等研究领域。
1. 培养基的配制烟草根部组织的培养需要一定的培养基，其配方一般为：MS 培养基+植物生长素+蔗糖。
其中，植物生长素促进细胞分裂及生长，而蔗糖则提供营养。
2. 培养过程将烟草根部通过消毒处理后，分离出细胞或组织，并在培养基中进行培养。
在培养过程中，需要定期更换培养基、调整植物生长素和蔗糖的浓度等。
培养成功后，可用于烟草药物成分的提取及分析，也可以进行基于基因工程的遗传转化等研究。
二、烟草根部药物分析1. 提取方法烟草根部中的药物成分主要是挥发油、黄酮类化合物等。
提取这些化合物的方法一般为：全浸法、超声波提取法等。
其中，超声波提取法操作简便、提取率高，被广泛使用。
2. 分析方法烟草根部中的化合物含量分析可通过高效液相色谱法、气相色谱法等进行。
这些分析方法对药物成分进行准确、可靠的定量分析，有助于研究烟草根部中的药物成分在医药、化妆品及食品等领域的应用。
三、烟草根部组织培养及药物分析的应用烟草根部的培养及药物分析对医药、化妆品及食品等领域具有重要意义。
在医药领域中，烟草根部中的化合物被广泛应用于抗炎、抗菌、镇痛等方面。
同时，在化妆品及食品领域，烟草根部的化合物也有很好的应用前景。
总之，烟草根部组织培养及药物分析是对烟草进行深入研究及利用的重要手段。
其可以为医药、化妆品及食品等领域的研究提供重要的基础，对于推动相关产业的发展具有重要作用。
细胞工程实验-烟草叶片的组织培养.
细胞工程学实验报告专业：_ 09级生物技术一班__ 姓名：___ __ 学号：____ _ _实验一实验室的设计及基本设备一、实验室的设计1、实验室设计的原因：植物细胞工程实验室的流程是：清洗玻璃器皿、配制培养基、高压气灭菌、无菌操作、培养室培养植物、植物材料的检测。
因此实验室需要有清洁器皿和配制培养基的准备室，无菌操作室或超净工作台，供培养材料用的培养室，检查培养情况并做记录的实验室。
一般在设计上，每个组分最好按工作的自然程序连续排列，如：准备室、灭菌室、无菌操作室、植物材料培养室、检测室。
实验室的安排应合理简洁，并要求无尘、灭菌、光洁、清净。
2、实验室的布局要求：（1）准备室准备室可以是一大间或几小间，主要用于进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器脿醮涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
必要的设备有:准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。
洗涤灭菌区功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。
要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。
在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。
中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。
如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。
准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。
设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。
（2）无菌室（接种室）进行植物细胞、组织培养操作的关键是无菌条件。
室内的墙壁要求光滑平整；地面为光洁的水磨石，平坦无缝，避免灰尘积累，便于清扫。
紫外灯一般在3到4平方米内安装1到2只；在工作台下安置紫外灯紫外灯可使灭菌彻底。
同时，工作台上方安装平板玻璃，以防操作时落灰。
条件不好时，用无菌箱代替无菌室，箱内用紫外灯灭菌。
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烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0)、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤1、MS培养基母液的配制注意：1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。
4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。
（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。
生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。
激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。
三、培养基配制和灭菌本次实验使用（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；（3）生根培养基：MS+NAA0.2mg/L。
注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得，MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。
母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1：母液吸取量=母液体积（CC）×（配制培养基的升数/母液浓缩倍数）公式2：母液吸取量=（培养基要求的含量/ 母液每CC的含量）（各种生长调节剂）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg，NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
配制培养基（1000ml）1.琼脂:称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。
3、各种母液的吸取（培养基1L）（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml （2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml （3）用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml（4）移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求 5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。
分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。
包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）具体操作步骤：1.高压锅放水至平把架；2.把包扎好的培养基装入高压锅;3.盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.4.然后接通电源.5.压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。
6.排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa 时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。
7.灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
8.经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
五、植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。
1、接种步骤：第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌：70%酒精浸10-30秒→→无菌水第三步：灭菌剂处理→→0.1-1%升汞5-8min（或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗注意事项：1.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存。
2.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次，升汞一般5-8次，每次不少于3min。
3.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底。
4.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。
5.灭菌液要充分浸没材料。
2、无菌操作可按以下步骤进行：（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。
然后搽拭工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。
（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。
微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
六、烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化（1）于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍3min；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块；接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。
接入（1）中培养。
（2）约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；（3）15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%（4）30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点（5）60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。
但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（2）上。
（6）3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。
七、诱导生根及移栽与数据记录取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（3）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。
当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。
烟草叶片愈伤组织诱导情况烟草叶片愈伤组织再生植株情况烟草叶片诱导生根情况。