烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养

一、实验原理与实验步骤

在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

植物材料：烟草植株

药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞

仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0)、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子

二、实验方法与步骤

1、MS培养基母液的配制

注意：

1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2、微量元素母液的配制

按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签

3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

生长调节剂母液配制：

为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。

称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。

三、培养基配制和灭菌

本次实验使用

（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；

（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；

（3）生根培养基：MS+NAA0.2mg/L。

注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得，MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。

母液吸取量的计算

配制培养基的升数

公式1：母液吸取量=母液体积（CC）×（配制培养基的升数/母液浓缩倍数）

公式2：母液吸取量=（培养基要求的含量/ 母液每CC的含量）（各种生长调节剂）

各种母液按顺序编号排列

A.大量元素；

B.CaCl2.2H2O；

C.微量元素；

D.铁盐；

E.有机物；

F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg，NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。

配制培养基（1000ml）

1.琼脂:称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.

2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水

中。

3、各种母液的吸取（培养基1L）

（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml （2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml （3）用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml

（4）移取激素

将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求 5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。

分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。

包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。

用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）

具体操作步骤：

1.高压锅放水至平把架；

2.把包扎好的培养基装入高压锅;

3.盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.

4.然后接通电源.

5.压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。

6.排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa 时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。

7.灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

8.经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。

进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。

五、植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌

外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。

1、接种步骤：