抗菌药物筛选的实验方法与技术

抗菌药物筛选的实验方法与技术
一、实验原理
体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。

药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。

培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。

主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。

培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。

此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。

按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。

固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂(常加1.5%-2%的琼脂)经融化冷凝而成。

半固体培养这是指在液体培养基中加入0.8％-1％左右的琼脂，经融化冷凝而成。

液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。

正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。

由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。

但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。

微量稀释法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。

一般应用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。

本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。

二、材料与方法
1，药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂等。

1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液。

2，材料与仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸、96孔板等。

3，实验方法
1，玻璃器皿的洗涤和包装；
2，液体及固体培养基的配制过程；
3，棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎；
4，培养基的灭菌；
5，斜面和平板的制作；
6，无菌水的制备；
7，斜面培养基接种；
8，液体培养基接种法；
9，微量稀释法体外抗菌实验：一般常用MH培养基，将已配制药液在试管中作二倍递减浓度稀释，分装于微量稀释板孔内或用微量加液器直接在稀释板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀后，置37℃温孵18-22 h，用酶标仪630nm侧吸光度。

（1）实验菌的准备。

选取大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、蜡状芽孢杆菌三种在营养琼脂斜面培养基上传代培养一次后，再将其接种至营养肉汤培养基中37℃培养6-12 h，冰箱备用。

（2）抗菌化合物的初步筛选，按下表取96孔培养板一块，进行编号，将44种化合物（由有机化学研究所其他教师和研究生提供）用DMSO或蒸馏水配制成50μmol/ml，（也可用无菌过滤器过滤后）放置在灭菌的小离心管中。

在超净工作台内，酒精灯下，将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为1：500或1:100。

用无菌的连续移液器（吸咀经过灭菌处理）将稀释的液体菌种200μl加入到除了A1,B1,C1,D1以外的孔内，2μl各种化合物溶液（DMSO配置），E1,F1,G1,H1加2μlDMSO，A1,B1,C1,D1加200 μl培养液，震荡混合后37℃培养12h-18h, 用酶标仪630nm侧吸光度。

DMSO的最终浓度保持在1%。

每个样品设两个平行孔。

表1 44种化合物于96孔板加样表
筛选数据分析：实验中，以培养基为空白0%，以带菌培养液为对照100%。

如果酶标仪630nm测试的结果中，空白为-0.2，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为+0.1-0.2。

如果测试
样品的值也同样达到-0.2，表明样品在200μmol/L具有较好的抗菌活性。

如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，可请选取11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。

(3) 最小抑菌浓度或EC50的测试
从上述筛选的对每种细菌抑制作用最好的化合物中选出11种化合物。

将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为1:500或1:100。

培养板样品的加入方法：
表1 11种化合物于96孔板加样稀释表
孔内预先加100μl含菌的稀释培养液，2μlDMSO。

第二行加由第一行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第三行加由第二行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第四行加由第三行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第五行加由第四行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第六行加由第五行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第七行加由第六行取出的100μl样品，混合后取出100μl加到下一行。

第八行加由第七行取出的100μl样品，混合后取出100μl倒掉。

最后在每孔内补加100μl含菌的稀释培养液，将培养板在37℃恒温箱中培养12-20h，用酶标仪630nm侧吸光度。

三、数据处理与讨论
1.数据处理
在44种化合物中选出11种化合物进行最小杀菌浓度或IC50的测试，通过分析数据得出：在对大肠杆菌的抑制研究中，1号、3号、6号所得OD值无相应规律性，无法计算最小杀菌浓度或IC50。

2号、4号、5号、7号、8号、9号、10号、11号化合物随浓度下降，OD值上升，为抑菌作用。

图1 2号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线
由图可得2号化合物IC50值在此实验浓度下难以估计，需要降低化合物浓度再次测定。

图2 4号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线
图3 5号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得5号化合物IC50值约为10.3μmol/L 。

图4 7号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线
图5 8号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得8号化合物IC50值约为3.98μmol/L 。

图6 9号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线
图7 10号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得10号化合物IC50值约为2.21μmol/L 。

图8 11号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线
由图可得11号化合物IC50值约为4.90μmol/L 。

在对金黄色葡萄球菌的抑制研究中，1号化合物测定各浓度OD值均为负值，故需配制浓度较低的溶液进一步研究，2、3、4、6、7号化合物数据无规律性，无法分析；11号数据均为正值，样品浓度偏低，需进一步研究；5号为抑菌作用，8、9、10号化合物为杀菌作用，最小杀菌浓度分别为3.91μmol/L、3.91μmol/L、7.81μmol/L 。

2.讨论
本实验中有些化合物浓度系列所测定的OD值无规律，误差较大，这与加样枪的操作、酶标仪的性能、样品与细菌的污染和活性差异等都有关。

本实验计算出了几种化合物对大肠杆菌的IC50值，以及某些化合物对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度。

四、感想
本实验中的96孔板已在其他实验中使用过，加样的逻辑性同学也已接触过，因此实验总的来说难度较小，但存在一些不可避免的误差。

本实验参与人员较多，需要同学之间的相互协调合作，才能有效提高实验效率。