一株选择性降解木质素菌的筛选及其对玉米秸秆的降解

1.2.6 紫外和红外扫描分析 紫外扫描分析： 参考文献 [13]采 用未经处理和经过 30 d固态发酵后的玉米秸秆粉制取水溶木 质素溶液， 采用 TU-1810型紫外可见分光光度计进行分析； 红外扫描分析： 分别对未经处理和经过10 d、20 d、 30 d 发酵后的玉米秸秆粉经 KBr压片法制片， 采用 Spectrum One FT-IR Spectrometer 进行分析.
Isolation of A Fungus with Selective Delignification and Its Degradation of Corn Stalk*
YAO Mengyin, LIU Xiaofeng, YUAN Yuexiang, YAN Zhiying, LIAO Yinzhang** & HE Rongna
2.2 菌株Y10对玉米秸秆的降解结果
2.2.1 失重率和木质素、 纤维素、 半纤维素的含量及相对含量 随时间的变化 由图 2可知， d 0~5，样品的失重率 较高， 为 8.74%， 而木质素、纤维素和半纤维素含量分别从 18.25%、 30.13%、23.58% 增加到18.34%、30.42%、24.16%， 说明在 0~5 d 时， 菌株 Y10主 要是 对基质中的可溶性 糖类等小 分 子 物质
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应用与环境生物学报
Chin J Appl Environ Biol
15 卷
g， MgSO4·7H2O 1.5 g， 加水至1 000 mL， pH自然； 固态发酵培养基： 准确称取玉米秸秆粉 5.00 g， 装入 250 mL的三角瓶， 再加入 9.00 mL蒸馏水 .
1.2.5 木质素、 纤维素、 半纤维素的相对含量
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌种来源 自分离的白腐菌 6株， 实验Leabharlann Baidu保藏的白腐菌9 株， 共15株 . 1.1.2 实验材料 玉米秸秆， 取自双流， 粉碎过40目筛， 备用. 1.1.3 培养基 实验中所用培养基如下： PDA培养基： 去皮马铃薯200 g， 葡萄糖 20 g， KH2PO4 3.0
1.2 方� � 法
1.2.1 选择性降解木质素菌的筛选 将菌种点接至 PDA平板 上， 待平板长满后用灭过菌的打孔器将培养的菌打成1.00 cm 的菌块， 每瓶固态发酵培养基接入两个菌块 . 于32 ℃培养15 d， 取样测定木质素、 纤维素和半纤维素的含量， 然后计算其 各组分的降 解 率以及 选择 性系数， 以选择 性 系数和木质素 降解率都相对较高的菌株作为目标菌株 .
15 ( 3 ): 427~431 应用与环境生物学报 2009， Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2009-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00427
一株选择性降解木质素菌的筛选及其 对玉米秸秆的降解*
姚梦吟 刘晓风 袁月祥 闫志英 廖银章** 贺蓉娜
[12]
DNA 提 取参照
中 基 因 组 制 备 的 方 法 ，以
引物 ITS-1 (5’-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3’) 和 ITS- 4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行 PCR扩增. PCR反应 条件： 预变性 94 ℃，5 min； 变性 94 ℃， 1 min； 复性 55℃， 1 min； 延伸 72 ℃， 1.5 min； 35个循环， 最终72 ℃， 充分延伸10 min. 经切胶纯化的 PCR产物连接到 PMD18-T载体 (Takara)上， 转化大肠杆菌感受态细胞， 检测到载体已连接到目的片段之 后交由上海英骏生物技术有限公司完成测序. 1.2.4 系统发育树的构建 将菌株 Y10的 ITS-5.8S rDNA测序结 果提交 GenBank核酸序列数据库进行 BLAST， 使用 Bioedit将 与之同源性较高的序列进行 clustalw比对， 通过 MEGA软件采 用邻位相邻法作出系统发育树.
利用率 . 一些选择性降 解木质素的白腐菌， 很少或不降 解纤 [5~7] 维素， 常被用于生物预处理方面的研究 . 在白腐菌降 解木 质纤维素基质的基础研究中， 对其选择性的研究也有报道， 但多数菌株选择性系数比较小或者选择性系数较高而对木 质素的降 解率较低 [3, 6, 8, 9]. 本文通过筛选得到一株选择性系 数和木质素降解率都相对较高的白腐菌， 并测定其对玉米秸 秆降 解的不同时期木质纤维素含量的变化以及紫外和红 外 光谱分析， 研究该菌株降解玉米秸秆中木质纤维素的情况和 选择性 . 本文对选择性降解木质素菌株的研究为采用生物方 法选择性去除木质素、 高效利用木质纤维素原料提供了参考 资料.
1.2.2 失重率及木质素、 纤维素、 半纤维素含量的测定方法
失
重率： 提取酶液后的物料于 60 ℃烘干即为降解后的物料重� ，
木质素含量采用美国能源部的方法 [10]进行测定， 纤维素和半 纤维素含量采用王玉万方法 [11]测定 . 1.2.3 ITS-5.8S rDNA 序列扩增与测序 《 分 子 生 物 学 实 验 指 南》
2 结果与分析
2.1 选择性降解木质素菌的筛选和鉴定
2.1.1 菌种筛选 固态发酵15 d后， 各菌株对玉米秸秆的降解 情况如表 1所示 . 由表 1可知， 15株菌中， 菌株 56的木质素降 解 率最高， 为 44.54%， 但其纤维素降 解率高于木质素降 解率， 选择性系数较低， 为 0.82. 菌株 Y10、 69、98、 67这 4 株菌的选 择性系数较高 (>2)， 其中 Y10 选择性系数 最高， 为 4.07； d 15 时菌株 Y10 的木质素降 解 率为 32.92%， 高于菌株 69、98、 67. 综合考虑选择性系数和木质素降 解率， 选择菌株 Y10 作下一 步研究 . 2.1.2 菌株Y10的ITS-5.8S rDNA 序列分析 菌株 Y10的 ITS5.8S rDNA序列测定片段长度为 640 bp， 序列提交 GenBank， 登录号为FJ977566. 将 菌 株 Y10 的 ITS-5.8S rDNA 序 列 在 Gen Ban k 中进 行 BLAST， 结果显示该菌株 ITS-5.8S rDNA 序列与下皮黑孔属 (Cerrena)的 4 株菌 (Cerrena consors) 相似性 最高，相似性为 99%， 可初步判定菌株 Y10为Cerrena sp. 据此选择 8株 Cerrena 属菌株， 以两株 Fungal endophyte作为外群种构建系统发育树 (图1).
收稿日期: 2008-11-25 接受日期: 2008-12-15 * 国 家“ 863 ”计 划 项目 ( No. 20 07A A10 0702) 、 中国 科 学 院 项目 ( Nos. KSCX2-YW-G- 008，K ZCX2-XB23- 07- 02) 和国家 科 技 支 撑计 划 项目 (Nos. 2006BAD07A02, 2006BAJ04B02)资助 Supported by the National “863”Project of China (No. 2007AA100702), the Projects of the Chinese Academy of Sciences (Nos. KSCX2-YW-G-008, KZCX2-XB23-07-02), and the National Science and Technology Pillar Programs of China (No. 2006BAD07A02, 2006BAJ04B02) **通讯作者 Corresponding author (E-mail: liaoyz@cib.ac.cn)
(中国科学院成都生物研究所 成都 610041)
摘 要 以玉米秸秆为基质， 对15株白腐真菌进行了初步筛选， 从中获得一株选择性系数较高的菌株 Y10， 经 ITS-5.8S rDNA序列分析， 初步鉴定为Cerrena sp.， 并研究了该菌在 30 d培养期内降解玉米秸秆中木质纤维素的情况 . 结果表明， 菌株 Y10对玉米秸秆中木质素和半纤维素的降解速率明显高于纤维素； 在 30 d的培养过程中， 该菌对玉米秸秆降解的 选择性系数都大于1， d 15选择性系数最高为 3.88. 紫外光谱和红外光谱分析结果表明， 经菌株 Y10降解后玉米秸秆的 化学成分发生了变化， 且对木质素的降解程度要大于对纤维素的降解程度. 图 4 表 3 参17 关键词 白腐菌； 玉米秸秆； 选择性降解； 木质素； 纤维素； 紫外光谱； 红外光谱 CLC X172 : X712
(Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China)
Abstract Fifteen white-rot fungi were screened with corn stalk used as degradation substrate. One white-rot fungus Y10 with high selectivity value was obtained, and it was identified as Cerrena sp. by ITS-5.8S rDNA sequences analysis. The degradation of corn stalk by Y10 in 30 days was then studied. The results indicated that the speed of degrading lignin and hemicellulose by Y10 was faster than that of cellulose; the selectivity value was above 1 during the 30-day cultivation and the highest reached 3.88 after 15 days. The compositions of corn stalk before and after degradation were analyzed through ultraviolet spectroscopy and infrared spectroscopy, respectively. It was found that the degradation degree of lignin was greater than that of cellulose by Y10. Fig 4, Tab 3, Ref 17 Keywords white-rot fungus; corn stalk; selective degradation; lignin; cellulose; ultraviolet spectroscopy; infrared spectroscopy CLC X172 : X712 木质素、 纤维素和半纤维素是构成丰富的可再生秸秆资 源的三大主要成份. 目前， 人类主要利用其中的纤维素， 如造 纸、发酵生产乙醇、生产饲料 [1, 2] 等. 木质素、纤维素和半纤 维素相互交织而形成植物细胞壁， 由于半纤维素比较容易降 解， 所以木质素的脱除是有效利用纤维素的关键所在 . 木质 素的脱除有生物降解和理化处理两种方法， 生物法与传统的 理化处理相比具有反应温和、二次污染少等优点， 因此成为 近年来研究的热点 . 白腐菌是已知的唯一能在纯系培养中有 效地将木质素降解为 CO2和 H 2O的一类微生物 [3]. 但有些白腐 菌如 Trametes versicolor 一般被认为是 一种典型的同时降 解 木质素和纤维素的白腐菌 [4]， 从而大大降低了纤维素资源的