肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选

*国家自然科学基金资助项目（编号：8106016），广西科学基金资助项目（编号：2010GXNSFD013048）△通信作者。

E －mail ：gwongluo@yahoo．com肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选*蒋日婷，晁耐霞，马平，李金平，罗国容△广西医科大学组织胚胎学教研室（南宁530021）【摘要】目的筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的可能作用奠定基础。

方法选择4种人肝癌细胞株（BEL －7404、HepG2、SMMC －7721和QGY －7703）及1种成人正常肝细胞株（HL －7702），培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后，采用免疫细胞染色技术和Western blot 的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株。

结果免疫细胞染色显示，GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达。

GCF2蛋白在肝癌细胞BEL －7404、HepG2、SMMC －7721和QGY －7703的表达要强于正常肝细胞HL －7702，其中以BEL －7404的表达量最高。

通过Western blot 检测，BEL －7404的GCF2相对表达量为0.875ʃ0.134，较其他细胞株高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

结论BEL －7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高，可以作为下一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料。

【关键词】肿瘤相关抗原；GCF2；肝癌；蛋白表达GCF2（GC binding factor 2）是一个转录抑制因子，能够抑制多个下游基因，比如EGFR 、TNF －α、PDGF －A 链和Igf2等的转录，参与细胞增殖、周期和凋亡等进程［1－6］。

本课题组前期用SEREX 技术筛选人肝癌组织构建的cDNA 文库，发现2个克隆与GCF2的片段同源，提示GCF2可能是肝癌相关抗原［7］。

目前，尚未见文献报道GCF2基因在肝癌中的作用的研究，因此，2010年11月至2011年3月，本实验将采用免疫细胞化学技术检测4种人肝癌细胞和1种成人正常肝细胞中GCF2的表达情况，并且通过Western blot 筛选出GCF2高水平表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用奠定基础。

1材料与方法1．1材料人肝癌细胞株BEL －7404、HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人肝细胞株HL －7702，均购于上海细胞生物学研究所。

实验仪器均由广西医科大学基础实验中心提供：CO 2恒温培养箱（Thermo ）、倒置显微镜（OLYMPUS ）、台式高速冷冻离心机（SIGMA ）、紫外分光光度计（UV2000I Tanon ）、电泳仪（北京六一仪器厂）、半干式转膜仪（BIO －RAD ）。

细胞培养基高糖DMEM 及RPMI 1640均购于HyClnoe 公司。

磷酸缓冲液（PBS ）、DAB 显色试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。

蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。

GCF2抗体购自美国Santa 公司。

辣根过氧化物酶（HRP ）标记的山羊抗鼠IgG 购自上海长岛生物试剂有限公司。

GAPDH 抗体、ECL 发光试剂购于碧云天生物技术研究所。

1．2细胞培养将4种肝癌细胞分别培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液中，将成人正常肝细胞株HL －7702培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，并置于37ħ、5%CO 2及饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天更换培养液。

1．3细胞爬片的制作及免疫组织化学检测将生长状态良好的人肝癌细胞株BEL －7404、HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人正常肝细胞株HL －7702接种于置有圆形盖玻片的12孔培养板内，接种密度为1ˑ104个细胞/孔，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 及RPMI 1640培养液在37ħ、5%CO 2条件下培养。

待细胞长到60% 70%融合时，用0.01mol /L PBS 洗涤1次，加入4%多聚甲醛室温固定15min 。

将盖玻片取出，粘贴在载玻片上，按照常规免疫组织化学方法，加入1ʒ100稀释的GCF2抗体，4ħ湿盒内温育过夜。

PBS 洗片后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ，室温下孵育30min ，PBS 洗片后进行DAB 显色2 3min 。

常规50% 100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，香柏油封片，显微镜下观察并拍照记录结果。

以PBS 替代一抗作为阴性对照。

采用Image －Pro Plus version 6.0软件分析阳性着色光密度。

1．4总蛋白的提取及Western blot 的检测常规细胞培养，当细胞贴壁生长达90%时，按蛋白提取试剂盒操作方法提取细胞总蛋白，分装后置于－80ħ保存。

取4个细胞株的蛋白20μg 与1/4体积的5ˑSDS 上样缓冲液混合，100ħ沸水浴5min ，冷却后点样进行SDS －PAGE 电泳分离。

电泳完毕，按照半干转移仪公司提供的说明进行印迹操作，将电泳分离蛋白转移到PVDF 膜上。

转移膜用含50g /L 脱脂牛奶的PBST （0.01mol /L PBS +0.5%Tween －20）室温封闭5h 。

GCF2抗体1ʒ200稀释液4ħ孵育过夜；按1ʒ5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP ）标记羊抗鼠IgG ，室温孵育1h 。

洗膜后滴加ECL 发光试剂及暗盒压片，扫描纪录结果。

采用Quantity one 软件进行凝胶电泳条带进行分析。

1．5统计学方法采用SPSS 13.0统计软件，不同组间比较采用单因素方差分析（one －way ANOVA ）。

免疫细胞化学平均光密度值分析采用四分位数法。

2结果2．1GCF2在5种细胞株中的免疫细胞化学检测情况在光学显微镜下观察，BEL －7404、HepG2、SMMC －7721、QGY －7703及HL －7702细胞中目的蛋白存在的区域均呈现棕黄色或褐色颗粒（图1）。

在BEL －7404、SMMC －7721、QGY －7703细胞中GCF2蛋白主要存在于胞质内，胞核内有少量表达；相反地，在HepG2及HL －7702细胞中主要存在于胞核内，在胞质内也有少量表达。

此外，GCF2蛋白在肝癌细胞株BEL －7404、HepG2、SMMC －7721、QGY －7703的表达要强于正常肝细胞HL －7702。

BEL －7404、HepG2、SMMC －7721、QGY －7703及HL －7702的平均光密度值中位数分别为0.1574、0.0179、0.0145、0.0384和0.0020，GCF2蛋白的表达在BEL －7404细胞较其他4种细胞显著。

阴性对照组细胞中看不到阳性着色（图1－F J ）。

A 、F ：BEL －7404；B 、G ：HepG2；C 、H ：SMMC －7721；D 、I ：QGY －7703；E 、J ：HL －7702；A E ：GCF2蛋白在5种细胞中的表达；F J ：PBS 替代一抗的阴性对照组；箭头所指：该组阳性染色细胞图1免疫细胞化学技术检测各细胞中GCF2蛋白表达情况（ˑ40）2．2GCF2在5种细胞株中的Western blot 检测情况用Quantity one 软件进行凝胶电泳条带扫描，BEL －7404的相对表达量最高，见图2、表1。

1：BEL －7404；2：HepG2；3：SMMC －7721；4：QGY －7703；5：HL －7702；6：Hela图2Western blot 检测各细胞中GCF2蛋白质的表达表1各组细胞GCF2蛋白质相对表达水平细胞株第1次第2次第3次相对表达量（珋x ʃs ）BEL －74040．8731．0110．7420．875ʃ0．134HepG20．8420．9190．6810．814ʃ0．121SMMC －77210．6230．4630．4230．503ʃ0．106QGY －77030．7540．5330．6890．659ʃ0．114HL －77020．8160．6960．7700．761ʃ0．0613讨论恶性肿瘤在我国的发病率已越来越高，而广西是恶性肿瘤的高发区，其中广西的肝癌病死率居全国第2位。

因此，对肝癌相关抗原的筛选和鉴定有助于肝癌的早期诊断和辅助治疗。

人GCF2基因位于2号染色体q37，mRNA 的大小为4.2kb ，其中开放阅读框大小为2256bp ，预测编码的蛋白质大小约为83kD ［7］。

本课题组前期用血清学初筛法发现GCF2抗体在大多数肝癌患者的血清中出现，也在部分乙型肝炎、淋巴瘤、肾细胞癌和黑色素瘤患者的血清中出现，但是在正常人血清中并未出现［8］，因此我们推测GCF2蛋白可能是一种广谱肿瘤相关抗原。

故本研究应用体外细胞培养，采用免疫细胞化学和Western blot 的方法从4种肝癌细胞中筛选出GCF2表达水平最高的细胞株，为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用奠定基础。

从研究的结果可知，GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达，但在不同细胞表达在胞核或胞质中的比例不同。

在BEL －7404、SMMC －7721及QGY －7703细胞中GCF2蛋白主要存在于胞质内，核内有少量表达，而HepG2与HL －7702则相反。

REED 等［1］在前期的研究中也发现在人T 淋巴瘤HUT －102细胞中GCF2主要表达在细胞核内，而在人表皮鳞癌A431细胞中则均匀表达在胞核及胞质中，并推测在细胞中的定位不一样可能与翻译后修饰有关。

我们还可以看到GCF2在4种肝癌细胞中的表达要强于正常肝细胞，这值得我们下一步对GCF2在肝癌发生发展中的作用进行研究。

Western blot证实，5种细胞株的条带大小都约为160kD，这与一些外国学者［1，7］所得出的结论一样。

此外，通过Western blot检测GCF2定位在胞核中的HepG2及HL－7702细胞较定位在胞质中的SMMC－7721、QGY－7703细胞的相对表达量高，这可能与GCF2在胞核中参与了一些信号通路或者调控因子，从而对其在细胞中的表达量增高。

本研究是为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用选取实验材料，后续将在人肝癌细胞株BEL－7404中利用siRNA干扰GCF2的表达，检测干扰前后细胞中GCF2蛋白表达的变化情况。

在近期的研究［9］中还发现，GCF2可能通过Dvls和RhoA来调节肿瘤细胞的细胞骨架结构。

因此，我们将对在干扰后的BEL－7404细胞的生长、周期、迁移和侵袭能力进行检测，进一步说明GCF2在肝癌细胞中作用和探讨出GCF2对肝癌发生发展的可能作用机制。

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