肿瘤细胞培养(完整版)
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养一、培养基1、RPMI-1640+ 10%胎牛血清培养基2、DMEM+ 15%胎牛血清培养基成分表二、实验前准备工作:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。
用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。
进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min 进行消毒。
紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。
以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
刷洗后经行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。
将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。
清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。
包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
肿瘤细胞分离培养(1)
肿瘤细胞分离培养操作流程1.准备好动物试验台。
提供无菌环境当然是最好的。
2.将一个10cm培养皿（无菌）置入操作台中，用来盛放肿瘤，放在冰上。
3.麻醉小鼠。
推荐异氟烷，因为它对代谢的影响最小。
4.腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带或大头针固定四肢。
为尽量减少因痛苦导致的麻醉动物过早苏醒，胶带是首选。
5.彻底清洁腹部和胸部区域，用乙醇或碘剂消毒。
此步骤既要求迅速又要求消毒彻底，因为动物的毛皮是第一个潜在的污染源。
如果动物有排便，一定要清理和消毒沾染粪便的区域。
（有文献建议断食12h）6.准备好所有必要的试剂。
7.主要实验材料：Defined K-SFM 无血清培养基、Ⅱ型胶原酶或胰蛋白酶、RPMI 1640、PBS，EGF（表皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维生长因子），青霉素和链霉素以及两性霉素B（0.25 mg / ml）。
8.最好在无菌环境中分装胶原酶，轻柔涡旋，并在37℃环境下使胶原酶溶解30-60分钟。
注意，虽然胶原酶溶解迅速，充分溶解30分钟以上的胶原酶具有更加稳定的消化效率（基于细胞总产量）。
9.用含青霉素及链霉素的RPMI 1640反复冲洗并剔除坏死组织后，在培养皿内用无菌剪刀反复剪切成约1 mm 3 大小的组织块。
10.收集剪切后的肿瘤组织置于底面积为25 cm 2的培养瓶中，用含有Ⅱ型胶原酶200-400 U/mL的Defined K-SFM 无血清培养基在5%的CO 2培养箱中37 ℃消化2h-3 h后，当大多数组织变成细胞悬浮液时，酶消化停止。
倒置显微镜下观察大部分细胞为单个细胞。
11.用RPMI 1640洗涤，300g离心5min，1-3次彻底去除胶原酶。
收集消化后的肺癌细胞。
12.用含EGF 20 ng/mL、bFGF10 ng/mL 的Defined K-SFM培养基悬浮细胞并转移到25 cm 2的培养瓶中，在5%的CO 2培养箱中37 ℃培养，（有文献报道建议先用有血清培养4h后换成无血清培养基，以便保持细胞形态）。
肿瘤细胞免疫细胞共培养步骤
肿瘤细胞免疫细胞共培养步骤（实用版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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肿瘤细胞培养基本方法
肿瘤细胞培养基本方法(一)准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。
用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。
培养基品牌货号D-MEM/F-12 GIBCO 12400024GIBCO 12800017 Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (highglucose)F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO 21700075Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder GIBCO 12200036Leibovitz's L-15 Medium powder GIBCO 41300039McCOY's 5A SIGMA M4892Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powderGIBCO 11900024 (MEMα)with ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO 12000022 Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder(MEMα)without ribonucleosides and deoxyribonucleosidesMinimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO 41500034NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'SSIGMA N3520 MODIFICATION (F12K)RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022EGF SIGMA E9644Sodium pyruvate SIGMA P2256-25GSIGMA M5017 MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS ANDL-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONA TE.CELL CULTURE TESTED2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。
它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。
本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养的基本原理肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。
培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。
二、肿瘤细胞培养的方法1. 细胞来源选择肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。
可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。
选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。
2. 细胞分离和传代细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。
分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。
3. 细胞培养条件细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。
首先是选择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。
4. 细胞检测和鉴定培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。
常用的方法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。
鉴定后的细胞可以用于进一步的实验研究。
三、肿瘤细胞培养的应用1. 药物筛选和耐药性研究肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。
此外，肿瘤细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。
2. 基因功能研究通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。
肿瘤细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。
肿瘤细胞培养
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癌细胞系的建立
（2）反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特 点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类 细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。
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癌细胞系的建立
待细胞生长达一定数量后用胰酶消化，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培
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癌细胞系的建立
（一）癌细胞原代培养
癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标 本收集和处理、原代培养、传代、换液、冻存、复 苏等过程。
培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适 宜的培养液和培养底物等几个方面。
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癌细胞系的建立
养液，吹打制成细胞悬液；
取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A瓶中，置温箱中静止 培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部 培养液，再接种入B瓶中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C瓶中；再 向B瓶中补加完全培养基。
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3、癌基因和抑癌基因方面的研究
实验证明癌的发生和发展与癌基因（原癌基因）和抑癌基因两 种基因的表达调控密切相关。
体外细胞培养既利于测定癌基因及癌基因表达产物，又可以 测定抑癌基因的表达水平。癌细胞的体外培养是定量研究癌 基因和抑癌基因表达调控的理想工具。
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癌细胞系的建立
（1）机械刮除法
肿瘤细胞培养技术-林星石
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肿瘤细胞in vitro的特点
细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化
变低分化 表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可
变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
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细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
肿瘤细胞
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细胞间的相互影响
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培养液特殊添加剂
常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂
终浓度
添加剂
终浓度
BSA transferrin insulin 氢化可的松
10-5mol/ml 5-10 g/ml
5 pg/ml 10-5mol/ml
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
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肿瘤细胞的培养
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技术-培养
原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。
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技术- 鉴定与建株
鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分 析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、 集落形成、致瘤实验（裸小鼠）
肿瘤细胞培养
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。
生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体中的停滞期。
过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。
从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。
从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。
肿瘤细胞培养图片汇总
一食管癌细胞株表达MMP－2：1.细胞种类：食管癌细胞株；2.培养的天数：2d; 细胞倍增时间—24h左右；3.放大倍速：倒置荧光显微镜，100倍；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长；6.图片目的：鉴定食管癌细胞表达MMP-2，胞浆中绿色荧光为MMP-2，细胞核红色荧光为PI复染。
二人前列腺LNCaP细胞1.细胞种类：人前列腺LNCaP细胞2.培养天数：传代后第3天；3.放大倍数：X10,倒置显微镜微分干涉；4.培养基种类：RPMI-1640+10%胎牛血清5.细胞状态与特征简述：贴壁生长，梭型三SGC7901细胞1.细胞种类：人胃肿瘤细胞；2.培养的天数：2天；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭型贴壁生长四HEPG21.细胞种类：人肝肿瘤细胞2.培养的天数：复苏后12小时；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长五用Psuper-HIFSiRNA载体转染A549的细胞：1.细胞种类：肺癌细胞株；2.培养的天数：用G418进行筛选后第10天；3.放大倍速：倒置显微镜，×20倍；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：同样具有典型的上皮细胞特点；6.该图为：用带有GFP的Psuper-HIFSiRNA载体转染A549细胞后，用G418进行筛选后10天得到的细胞克隆(暗视野)六组织细胞淋巴瘤1.细胞种类：U9372.培养的天数：2d；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图七人前列腺癌细胞1.细胞种类：PC－32.培养的天数：3d；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：1640+10%X小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈不规则梭形，贴壁生长。
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。
一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。
用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。
也可以考虑动物媒介培养。
根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。
具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。
二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。
三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。
近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。
但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。
众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。
另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。
肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。
肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该CO2越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。
无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。
总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。
基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。
附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。
Hela肿瘤细胞培养操作规程
Hela肿瘤细胞培养操作规程一、实验准备1、细胞培养室的灭菌消毒细胞培养室及操作台用75%酒精擦洗3遍2、实验所需器材准备（1）移液器枪头的灭菌、烘干。
（2）3、培养基及溶液的配制PBS溶液的配置：培养基的配置：二、细胞的复苏操作1、把冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出来后，立即37℃水浴，同时轻微摇动。
待液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3、把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5、3天换一次培养基。
三、细胞的传代1、培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2、把原有培养基吸掉。
3、加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4、细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7、倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8、根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。
继续培养。
四、冻存细胞消化下来并离心（同上）。
用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分把钟，写明细胞种类，冻存日期。
4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
要注意的就是无菌操作！培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。
用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。
在超净台内过滤。
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。
培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。
1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
以（5~10）x108个/L 细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。
3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，
再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。
肿瘤浸润细胞培养方法
肿瘤浸润细胞培养方法【导语】肿瘤浸润细胞培养是癌症研究中的一个重要环节，对于探索肿瘤的发生、发展和治疗具有重要意义。
本文将详细介绍肿瘤浸润细胞的培养方法，以期为相关领域的研究提供参考。
【正文】一、肿瘤浸润细胞的概述肿瘤浸润细胞是指在肿瘤组织中存在的具有免疫活性的细胞，主要包括T 细胞、B细胞、巨噬细胞等。
这些细胞在肿瘤微环境中发挥重要作用，可影响肿瘤的生长、侵袭和转移。
对肿瘤浸润细胞进行体外培养，有助于深入研究其生物学特性及在肿瘤发生发展中的作用。
二、肿瘤浸润细胞的培养方法1.样本采集从新鲜的肿瘤组织中分离肿瘤浸润细胞。
首先，将肿瘤组织剪切成小块，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）清洗，去除血细胞和杂质。
2.细胞分离将清洗后的肿瘤组织放入含有胶原酶和DNA酶的消化液中，在37℃的条件下消化1-2小时。
消化结束后，通过过滤和离心等方法分离细胞。
3.细胞培养（1）细胞计数：使用细胞计数板对分离得到的细胞进行计数，并调整细胞浓度为合适的范围。
（2）细胞接种：将细胞接种在含有10%胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基中。
（3）培养条件：在37℃、5% CO2的条件下培养细胞。
4.细胞纯化为了提高肿瘤浸润细胞的纯度，可采用免疫磁珠分选法对细胞进行纯化。
具体方法如下：（1）标记：使用特异性抗体标记肿瘤浸润细胞。
（2）磁珠分选：将标记好的细胞与磁珠混合，在磁场中进行分选。
（3）收集：收集纯化后的细胞，用于后续实验。
5.细胞传代细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
传代时，可用胰蛋白酶或EDTA 消化细胞，然后按照1:3-1:5的比例进行传代。
三、注意事项1.在细胞培养过程中，要密切观察细胞生长状态，定期更换新鲜培养基。
2.避免细胞过度生长，以免影响细胞活力。
3.严格无菌操作，防止细胞污染。
4.根据实验需求，选择合适的细胞纯化方法。
肿瘤细胞的实验报告
一、实验目的1. 了解肿瘤细胞培养的基本原理和方法。
2. 观察肿瘤细胞的生长特点、形态变化及细胞周期。
3. 掌握显微镜观察技术，提高对肿瘤细胞的识别能力。
二、实验原理肿瘤细胞是指在体内发生异常增殖的细胞，其生长速度较快，细胞周期缩短。
在体外培养条件下，肿瘤细胞能够保持其生物学特性，为研究其生物学行为提供有力手段。
本实验通过培养肿瘤细胞，观察其生长特点、形态变化及细胞周期，为进一步研究肿瘤的发生、发展及治疗提供实验依据。
三、实验材料1. 肿瘤细胞株：人肝癌细胞株（HepG2）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）。
2. RPMI-1640培养基：含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素、链霉素）。
3. CO2培养箱。
4. 显微镜及配套设备。
5. 计时器。
四、实验方法1. 肿瘤细胞复苏：将冷冻保存的肿瘤细胞取出，放入37℃水浴中解冻，然后接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞长满培养瓶底时，用胰酶消化细胞，按照1:2的比例传代。
3. 观察细胞生长：每天观察细胞生长情况，记录细胞生长状态。
4. 显微镜观察：取生长良好的细胞，用显微镜观察细胞形态、大小、排列等。
5. 细胞周期检测：采用流式细胞术检测细胞周期。
五、实验结果1. 细胞生长特点：肿瘤细胞在体外培养过程中，生长速度快，细胞周期缩短，细胞密度较高。
2. 细胞形态变化：肿瘤细胞呈圆形、多角形或不规则形，细胞核较大，核仁明显，细胞质丰富。
3. 显微镜观察：通过显微镜观察，发现肿瘤细胞呈典型的异型性，细胞排列紧密，形态多样。
4. 细胞周期检测：流式细胞术检测结果显示，肿瘤细胞处于G1期、S期、G2期和M期，细胞周期缩短。
六、实验讨论1. 肿瘤细胞在体外培养过程中，能够保持其生物学特性，为研究肿瘤的发生、发展及治疗提供有力手段。
2. 本实验通过观察肿瘤细胞的生长特点、形态变化及细胞周期，为后续研究提供了实验依据。
3. 肿瘤细胞的异型性是肿瘤诊断和鉴别诊断的重要依据，本实验通过显微镜观察，进一步证实了肿瘤细胞的异型性。
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第6章肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。
癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养的生物学特性1、形态和性状形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。
折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。
2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。
另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。
4、侵润性侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。
5、异质性所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
6、细胞遗传性失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体出现，正常细胞与恶性肿瘤细胞的区别，如表6-1所示。
二、培养肿瘤细胞的生物学特性的检测体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定，其目的在于：证明培养的细胞是否来自原来的肿瘤细胞。
说明肿瘤组织类型。
描述肿瘤细胞的生物学特性。
通常要检查下列项目：1、组织起源应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要时要提供病理诊断鉴定资料。
2、形态观察观察细胞一般形态如细胞形状，核浆比例倒置，有丰富的三极或多极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱。
3、细胞生长特点检测细胞生长曲线，细胞分裂指数，倍增时间及细胞周期。
癌细胞失去正常的接触抑制，呈多层生长，生长旺盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指数较高，具无限增殖能力，细胞浸润能力较强等。
4、软琼脂培养癌细胞在低密度下仍具有高度存活率，并在软琼脂中形成集落。
5、细胞核型分析检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等，癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有标记染色体。
6、动物致瘤试验裸鼠背部皮下接种1×109~2×109/L癌细胞能生长形成实体瘤，其组织学形态与原发瘤相似。
7、组织化学检查癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，碱性磷酸酶下降，乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性也改变。
8、其他生物学特性检测有凝集试验等。
三、肿瘤细胞的取材和培养(一)肿瘤细胞的取材方法培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。
1、实体瘤取材方法取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培养液保鲜，尽快进行培养。
尽可能去除溃疡及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含二性霉素B 2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，链霉素500μg/mL的培养液中浸泡10～20分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。
2、体腔液的取材方法在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。
3、血液(骨髓)取材法白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离培养。
(二)肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A 等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清(1%～2%)以利细胞生长，培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。
原代细胞的培养方法如下：1、组织块培养法将取得的瘤组织去除脂肪\结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。
2、酶消化法在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或(2000u/ml胶原酶)在37℃水浴中消化30分钟(或更长一些)，去除消化液，用洗液洗3次，培养液洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
以5×108～10×108/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI1640(或Eagle MEM或DMEM)中37℃ 5% CO2下分瓶(或皿)培养。
3、钽网培养法在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块(1~2mm3大小)，用镊子轻压，使其粘于网上，再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃ 5% CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
3、脱落细胞法将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶(或皿)中、37℃ 5% CO2下培养，每隔2～3天换液，7～10天上皮细胞逐渐长成单层。
在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。
因此，尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞长期培养建系的关键，现已发现有许多因素能抑制成纤维细胞生长(见表6-2)。
表6-2 抑制成纤维细胞生长的因素方法因素组织细胞选择性附着胰蛋白酶胶原酶胚胎小肠、心肌表皮乳癌选择性附着底物聚丙稀酰胺聚四氟乙烯(Teflon)胶原(猪皮) 各种肿瘤转化细胞表皮细胞汇合饲细胞层小鼠3T3人胎小肠表皮正常和恶性乳腺上皮结肠癌选择性培养基D-缬氨酶(Valine)MCDB-710MCDB-153Phenobarbitone 肾组织乳腺表皮肝细胞(三)成纤维细胞的排除方法为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。
1、机械刮除法用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝)或裹上少许脱脂棉制成，装入试管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。
程序如下：(1)标记镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面圈下肿瘤细胞的部位。
(2)刮除弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间。
(3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。
(4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。
2、反复贴壁法根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。
方法如下(同贴壁传代)：(1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。
(2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B 瓶中，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。
(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)。
三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。
3、消化排除法此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下：(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。
(2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。
4、胶原酶消化法本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。
(2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。
5、密度梯度离心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重 1.025～1.085的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min离心10分钟，在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重为1.065～1.085层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。
最近，有人用SOD来抑制成纤维细胞的生长，这些方法都需进行预试验取得经验，找出适合条件，才能获得好结果。
(四)血癌细胞分离培养1、采血与分离白细胞用肝素抗凝的注射器无菌抽取白血病患者外周血5～10mL，置无菌离心管中，斜放于37℃的水浴中，待红细胞沉淀后，将血浆部分吸入另一离心管中，以1500r/min离心15分钟，收集细胞，用含20%小牛血清的RPMI1640[含50u(μg)/mL青、链霉素]培养液调整细胞浓度至1×109细胞/L以上，开始接种浓度要大。