LAMP,bDNA,NASBA技术原理与应用比较——北京蓝谱

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LAMP方法与其他基因扩增法的比较
LAMP Temperature ◎ 65℃ ℃ Isothermal Number of primers Number of enzymes Special reagents Detection Amplification time Total cost △ ◎ ◎ 4 1 None ○ ◎ ◎ △ PCR 60℃⇔95℃ Thermal cycler 2 1 None ○ △ ○ ◎ TMA 40℃ Isothermal 2 2 or 3 NTP △ △ △ ◎ SDA 60℃ Isothermal 4 2 dNTPαS △ ○ ◎ △ LCR 60℃⇔95℃ Thermal cycler 4 1 or 2* None
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常用反应体系
FIP,BIP: F3,B3: loopF,B: dNTP: Betaine: Tween20: (NH4)2SO4: MgSO4: KcL: Tris-Hcl(pH8.8): Bst : 40pmol 5pmol 20pmol 1.4mM 0.8M 0.1% 10mM 8mM 10mM 20mM 8U
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二、NASBA技术原理与应用
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NASBA检测应用
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NASBA检测技术特征
使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环 反应. 上游引物带有Ｔ７RNA聚合酶结合位点，下游引 物带有ＥＣＬ检测核苷酸序列，此外，还有一条 俘获探针用于固定扩增产物． 扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂． 连续等温反应,特殊仪器进行检测, 特异性强，灵 敏度高，但成本也非常高昂． 可与分子信标探针联合使用，进行单管实时荧光 检测．
提取样本
1小时之内 小时之内
检测完成
LAMP=快速、简便、高特异、低成本 BJLP
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LAMP检测法特征
检测是连续等温进行的。 扩增效率十分高，反应灵敏。 采用4条引物，识别6个位点，特异性强。 不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。 反应不需要开盖，在一管内完成全部检测。 利用Bst酶的链置换功能进行反应。 加入反转录酶，可以完成ＲＮＡ的一步法检测。
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核酸等温检测技术 信号的放大 bDNA (branched DNA) 模板的扩增
TAS(Transcription-Based Amplification Systems)
３ＳＲ(self-sustained sequence replication) ＮＡＳＢＡ(nucleic acid sequence-based
◎ amplification △ additional step △ additional step △ additional step △ additional step ～ ◎ 15～ 60 min. △ ◎ 2～3 hrs △ △ 2～3 hrs △ △ 1～2 hrs △ △ 2～3 hrs △
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bDNA检测应用
Detection of Trypanosoma brucei spp. in Human Blood by a Nonradioactive Branched DNA-Based Technique
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bDNA检测技术特征
５条探针，其中只有两条目标探针要设计，其它 探针都可以模块化。 目标检测片段不会进行数量扩增。 样本处理十分简单，不需要纯化ＤＮＡ。 避免了扩增产物的污染问题。 避免了ＰＣＲ抑制因素可能带来的假阴性问题。 试剂无需冷藏保存。 采用仪器或照相机检测化学发光。 可高通量进行检测不同病原体。
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LAMP结果分析
LAMP实时浊度仪 LA-320C 仪器特点： 1.LAMP方法研究/检测专用，每隔6秒测定反应产物的浊度． 2.可以设定相应的反应条件与检测要求． 3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析． 4.检测结果（图像等）可以打印． 5.实时浊度仪LA-320C可同时检测32个样本，LAMP８联管适用．
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谢谢大家
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amplification)
ＳＤＡ(strand displacement amplification) ＬＡＭＰ(loop-mediated isothermal amplification)
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一、bDNA技术原理与应用
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bDNA的合成
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LAMP检测法特征 简易操作过程（以甲型流感为例、利用荣研试剂盒） 简易操作过程（以甲型流感为例、利用荣研试剂盒）
新型
A型
提取咽拭子 放在抽取液中 加入样本 加入反应引物 颠倒混合5次
RT-LAMP 反应 35分钟 用干粉试管 干粉状试剂 （可常温保存）
结果判断 目测或浊度仪
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LAMP技术原理与应用
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B3 5’
B2
B1
F1C
F2C
F3C
3’
LAMP引物位置与命名 LAMP引物位置与命名 FIP=F1C+TTTT+F2 BIP=B1C+TTTT+B2 B3 F3 (Loop F, Loop B)
引物Ｔ 引物Ｔm值的选择 F3,B3<F2,B2<F1,B1 60<F2,B2<65
钙黄绿素 Mn2+
结合
DNA
聚合酶
扩增反应
钙黄绿素
∨
dNTPs Mg2+
∧
结合
Mn2+ P2O74
－
Pyrophosphate Mn (white precipitate) )
＋
+ (white precipitate))
Pyrophosphate Mg
Template (SARS-CoV)
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bDNA,NASBA,LAMP 技术原理与应用比较
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——日本荣研指定中国 日本荣研指定中国LAMP技术推广者 日本荣研指定中国 技术推广者
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核酸检测技术
变温检测技术 PCR (polymerase chain reaction) LCR(ligase amplification reaction) Real-time PCR 等温检测技术 ——LAMP等
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LAMP结果分析——荧光
一种螯合试剂)与镁离子结合并处于熄灭状态 在反应液里的钙黄绿素 (一种螯合试剂 与镁离子结合并处于熄灭状态。 一种螯合试剂 与镁离子结合并处于熄灭状态。 由于LAMP扩增反应会生成焦磷酸离子、而这些焦磷酸会与镁离子结合并释放了钙黄绿素、 扩增反应会生成焦磷酸离子、而这些焦磷酸会与镁离子结合并释放了钙黄绿素、 由于 扩增反应会生成焦磷酸离子 这也导致了自由的钙黄绿素分子的熄灭效应终止并发出荧光。 这也导致了自由的钙黄绿素分子的熄灭效应终止并发出荧光。 荧光目视检测的反应过程
从图表中可以看出，不论是反应步骤还是反应时间，LAMP方法都优于其他方法。
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LAMP检测法总结
简易 – 采用恒温扩增反应。不需要先经过变性过程。 采用恒温扩增反应。不需要先经过变性过程。 快速 – 扩增反应可在 15 – 60 分钟内完成。 扩增反应可在 分钟内完成。 高特异 – 针对六个特定的区域设计四个不同的引物、LAMP法能准确 针对六个特定的区域设计四个不同的引物、 法能准确 的对目标基因进行扩增反应。 的对目标基因进行扩增反应。 – 检测可借由判定有无扩增产物来决定。 检测可借由判定有无扩增产物来决定。 低成本 – 只需要一种链置换反应聚合酶。 只需要一种链置换反应聚合酶。 – 不需要特殊的试剂或仪器。 不需要特殊的试剂或仪器。
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LAMP引物设计原则
引物间的距离
F2与B2之间的碱基数约为120-180个,F2与F3或者B2与B3间的碱基数为20个 以内,F2与F1或者B2与B1之间碱基数为40~60个，B1与F1之间可以没有碱基 间隔。
引物的Tm值
正常情况下或者富含GC区域为60-65度，富含AT区域为55-60度。
引物末端的稳定性
F1C与B1C的5’端，F2/B2，F3/B3的3’端6个碱基的dG值要小于-4kal/mol.
GC含量与二级结构
GC含量约40-60%。尽量避免二级结构的产生，尤其是3’端。
其它事项
在目标区域引物以外的序列中存在的限制性内切酶位点，可以用来确认扩增产物。
有无扩增反应可在UV灯下观 有无扩增反应可在 灯下观 测颜色的变化 有无扩增反应可借助肉眼判断扩 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 定
不需要特殊的试剂或仪器
－
＋
－ 模板:PSA 模板
＋
模板: 模板 PSA 荧光剂: 荧光剂 Ethidium Bromide (0.5 ug/ml)
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Loop引物的引入有助于提高灵敏度， 缩短反应时间
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LAMP扩增产物电泳分析
Ladder-like pattern in gel-electrophoresis
注：电泳分析为说明手段，并不建议在研究中使用
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LAMP结果分析——浊度