肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。

Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌

注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。

培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。BT01-100 蠕动泵( 保定格

兰蠕动泵有限公司)、Sorvall 低温离心机( 美国 Kendro 公司), CL-800 全自动生化分化仪( 日本岛津), XD-101 倒置显微镜( 南京光学显微镜公司)。 Heraeus CO 2孵箱( 美国 Kendro公司), KT-902 洁净室( 无锡康达净化空调设备厂)。

实验步骤：

一、原代大鼠肝细胞的分离

1.实验动物 Spragure- Dawley （ SD ）大鼠购自泸州医学院实验动物中心。雄性，清洁级，体重 150～200g，8～12 周龄。分笼饲养，喂饲标准的大鼠饲料，随意饮水，保持室温 20 ℃～25 ℃。

2.主要仪器设备: 倒置相差显微镜（）；自动平衡微型离心机：LDZ4- 0.8 北京医用离心机厂；套管针（）；超净工作台（）；电子分析天平（）；外科手术器械（）

3.主要试剂及药品：Ⅳ型胶原酶（）；RPMI1640培养基（）；胎牛血清（）；台盼蓝（）；Percoll分离液（）；PBS缓冲液（）；青霉素（80万U）及链霉素（100万U）（）胰岛素、高血糖素、转

铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松

4.具体实验步骤： SD 大鼠，氯胺酮80 mg/kg 腹腔内麻醉．同时腹腔内注射 1 000 U 肝素钠注射液抗凝．固定大鼠仰卧位于超净工作台上（用前紫外灯照射超净台半小时），剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性分离门静脉和下腔静脉，并在各静脉下放置1 根 4 零细线，暂不结扎，用套管针

以约15°角在门静脉远端向近端平行刺入（注意针头刺入在距离门静脉 3 个分支处 0.5 cm，刺入过深势必影响灌注效果）．细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次输液器一端，另一端接上输液瓶（预热灌流液的输液瓶用保温套保持温度以避免温度下降过快以影响酶的消化活性）．输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏 120 cm．打开输液器输钮将预热至 37 ℃无钙灌流液 200mL 经一次性输液管道及连接其末端的套管针流入门静脉，控制流速约20 mL/min；另一套管针头立即插入肝下下腔静脉，细线结扎固定以防针头由下腔静脉内脱出并退出金属针心，让血液和灌流液从下腔静脉流出，用无菌平皿接流出液，保持流出端无菌，同时打开胸腔结扎肝上下腔静脉，数分钟后肝脏逐渐肿胀变淡黄色．直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液．约 5～10 min，改输预热至 37 ℃的 0.05%Ⅳ型胶原酶灌流液 100 mL继续灌流，更换流出端的平皿，以回收胶原酶以循环使用，控制约 10 mL/min．灌流持续约 5～10min， 0.05%Ⅳ型胶原酶灌流过程中，取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏表面，以判断肝脏消化的程度，待压迫肝脏后不再回缩．表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流。离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏完整取下（注意不要碰破胃肠组织，避免造成污染），置于无菌平皿。用眼科镊钝性撕裂肝组织，4 ℃ RPMI 1640 完全培养基终止IV型胶原酶的消化作用，装入无菌 100 mL 三角烧瓶置摇床上，100 r/min，摇 10 min，所得的肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤，以除去一些大的细胞团块及被膜组织，再装入 50 mL