内源激素测定
竹子内源激素HPLC测定方法改良
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第３
研
究
汇
刊
Ｖ０． ０．Ｎｏ ４ １３ ．
Ｎｏ ．，２ ０ １ ｖ １
２０１１年 １１月
Ｊ ＲＮＡ ＡＭＢ Ｓ ＡＲＣ ＯＵ Ｌ ＯＦ Ｂ ＯＯ ＲＥ Ｅ Ｈ
竹子内源激 素 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ测定方法改 良
方 楷 杨光耀 杨 清培 施建 敏 于 芬 刘腾 飞
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月季切花内源激素含量ELISA测定方法的建立
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较高， 设备要求也较高的高效液相色谱 法 （ Ｐ Ｃ） ＨＬ 和色谱 一 质谱联用法 （ Ｃ ＭＳ） 、利用某种分 Ｇ — … 子相同的标记激素（ 抗原） 非标记的抗原与专一性 和 的抗体 （ ｂ 进行 竞 争性 抑 制反 应 的放 射 免疫 法 Ａ） （ Ｉ 喁 用酶代替放射性同位素做标 记物的酶联 ＲＡ）０ 及 免 疫 测 定 法 ‘ 其 中 酶 联 免 疫 吸 附 法 。 （ｎｙ ｅ ｌ ｋ ｄ ｍ ｎ ｓｒｅ ｔ ｓａｓ 简 称 Ｅ ｚｍ —ｉ ｅ Ｉ ｍｕ ｏ ｏｂ ｎ Ａ ｓｙ ， ｎ Ｅ ＩＡ法） ＬＳ 应用于植物激素的测定具有前处理简便 、 测定快捷 、 灵敏度好 、 特异性高的特点， 适用于大批 样 品的测定， 目前广泛应用 于植物激素的研究测定 （ Ｅｈ ） 除 ｔ 外 和临床医学等其它方面的检测 ［。 １ ０ １ 月季切 花 （ ｏａＣＳ ） Ｒ ｓ Ｖ， 为世界 著 名 的四大切 花 之一 ， 在月季切花瓶插后代谢机理及保鲜剂处理后
ｂ ｓ ｄ ｏ Ｉ Ａ ｓ ｔｏ ｕ ｅ ， ｅ ｗａ ｆｄ ｔ ｒ ｎ ｎ ｏ ｅ ｏ ｓｈ ｒ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｄ ｕ ｏ ｅ ｂ ｅ ｎ ａ ｅ ｎ ＥＬ Ｓ Ｗａ ｉ ｒ ｄ ｃ ｄ ｔ ｙ ｏ ｅ ｅ ｍｉ ｅ ｅ ｄ ｇ ｎ ｕ ｏ ｎ ｈ ｍ ｎ ｏ ｔ ｎｔ ｉ ｅ ｃ ｔｒ ｓ ａ ｄ ｏ ｎ ｉ ｓ ＥＬ Ｓ Ｗａ ｕ ｔ ｐ ． ＩＡ ｓ ｂ ｉ ｕ ｌ
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量
超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量摘要:利用超高效液相色谱法同时测定柑橘(Citrus reticulate Bance)果肉中的玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量｡以C8色谱柱,甲醇-0.1%冰乙酸为流动相梯度洗脱,检测波长为262 nm,流速0.22 mL/min｡结果表明, 玉米素含量在0.14~0.38 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 5,平均回收率为98.7%,RSD为0.99%;赤霉素含量在0.67~1.79 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 3,平均回收率为98.6% ,RSD 为0.70%;吲哚乙酸含量在0.25~0.67 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 6,平均回收率为99.0% ,RSD为0.68%;脱落酸含量在0.036~0.096 μg/mL间线性关系良好,R2为0.999 9,平均回收率为99.1% ,RSD为0.61%｡该方法简便､快速､精密度高､准确性好,可用于植物样品中激素含量的测定｡关键词:柑橘(Citrus reticulate Bance);植物激素;超高效液相色谱法Determination of Four Endogenous Hormones in Orange Pulp by UPLC Abstract: Determination of four endogenous hormones such as zeatin (ZT), gibberellin (GA), indole acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) was proceeded by UPLC. The method used a C8 column, and adopted the gradient elution method with methanol-0.1% acetic acid as mobile phase and the UV detection wavelength was 262 nm, and flow rate was 0.22 mL/min. The calibration curve of ZT was linear between 0.14 μg/mL and 0.38 μg/mL, R2 was 0.999 5, the average recovery was 98.7%, and RSD was 0.99%.The calibration curve of GA was linear between 0.67 μg/mL and 1.79 μg/mL, R2 was 0.999 3, the average recovery was 98.6%, and RSD was 0.70%.The calibration curve of IAA was linear between 0.25 μg/mL and 0.67 μg/mL, R2 was 0.999 6, the average recovery was 99.0%, and RSD was 0.68%. The calibration curve of ABA was linear between 0.036 μg/mL~0.096 μg/mL, R2 was 0.999 9, the average recovery was 99.1%, and RSD was 0.61%. This method was proved to be simple, precise, accurate and could be used for the quality control of hormone content in the plant samples.Key words: Orange pulp(Citrus reticulate Bance); plant hormone; UPLC植物性内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物,其生理效应复杂多样,对植物生长发育有重要的调节控制作用[1,2]｡吲哚乙酸､赤霉素､脱落酸､玉米素是植物体广泛存在的植物激素,本研究运用超高效液相色谱(UPLC)法同时测定柑橘中这4种内源激素,利用UPLC超高分离度､快速､超高灵敏度的优点,解决传统HPLC在植物激素分析中存在的分离度差,分析时间较长的缺点｡本研究建立了植物内源激素高效､稳定､准确的分离和测定方法,为植物内源激素调节其营养生理与生长的研究提供支撑｡吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素,属吲哚类化合物,又名生长素,其基本作用在于调节植物生长;赤霉素(GA)是一类属于双萜类化合物的植物激素,典型生理作用是能促进枝条的生长,尤其是能促进无伤害植物的整体生长;脱落酸(ABA)是一种具有倍半萜结构的抑制生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,具有加速植物器官脱落,抑制整株植物或离体器官的生长,并对细胞的分裂与生长起抑制等作用;玉米素(Zeatin)是一种天然的细胞分裂素,化学名称为6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤,它是从甜玉米灌浆期的子粒中提取并结晶出的第一个天然细胞分裂素,能刺激植物细胞分裂,促进叶绿素形成,加速植物新陈代谢和蛋白质的合成,从而达到有机体迅速增长,促使作物早熟丰产,提高植物抗病抗衰抗寒能力｡1 材料与方法1.1 仪器和试剂ACQUITY Uitra Performance LC超高效液相色谱系统,Empower色谱工作站,检测器:PDA eλ Detector紫外检测器(Waters公司);台式系列数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)｡玉米素标准品(Sigma公司,纯度87.0%);赤霉素标准品(SUPELCO公司,纯度96.5%);吲哚乙酸(Riedel-de Haen公司,纯度99.0%);脱落酸(Sigma公司,纯度99.0%);甲醇(色谱纯);冰乙酸(分析纯);超纯水;C18柱(500 mg/6 mL,美国赛分科技公司)｡1.2 实验方法1.2.1 样品采集实验所用的柑橘样品均采自广西全州｡在不同时间共采集6组样品｡摘取生长中的柑橘果实,迅速放入冰盒中带回实验室,-20℃保存备用｡1.2.2 色谱条件色谱柱:ACQUITYUPLCRBEH130 C8,1.7 μm(2.1×50 mm);流动相:甲醇-0.1%冰乙酸梯度洗脱;流速0.22 mL/min;检测波长为262 nm;柱温为25 ℃｡1.2.3 标准溶液的制备分别精密称取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸､脱落酸标准对照品0.12､0.28､0.21､0.15 mg置于50 mL容量瓶中,50%甲醇溶解定容,配制浓度分别为2.4､5.6､4.2､3.0 μg/mL的标准储备溶液｡1.2.4 样品溶液的制备称取已匀浆的柑橘果肉5.000 0 g置于25 mL容量瓶中,用80%甲醇溶解,冰水浴超声45 min,取出恢复常温后,80%甲醇定容,过滤,取过滤液10 mL于10 mL分度比色管,氮吹去除甲醇,残留液于C18柱中脱色,用6.0 mL 流动相分3次洗脱,用10 mL分度比色管收集所有从C18柱的流出液,流动相定容至8.0 mL,用0.22 μm有机滤膜过滤,滤液即为待测液｡1.2.5 四种植物激素混合标准曲线的制备分别吸取玉米素､赤霉素､吲哚乙酸及脱落酸标准储备溶液0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6 mL于6个10 mL容量瓶中,流动相定容至刻度,依次进样,进样体积为5.0 μL｡2 结果与分析2.1 提取方法的确定据文献报道,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸4种激素可采用67%的丙酮水溶液[1]､0.5 moL/L NaOH溶液[3]､80%甲醇水溶液[4]等溶剂提取,石油醚､乙酸乙酯､PVP和C18柱等方式净化,根据4种激素对时间和热不稳定[4],易发生降解反应,所以在实验操作过程中应注意控制时间及温度,本试验通过对不同的提取溶剂,提取方式(超声提取､过夜浸提)､提取时间､提取次数分别做单因素考察实验,最终确定以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件｡2.2 色谱条件的选择2.2.1 色谱柱的选择植物样品中含杂质量较多,分离难度较大｡UPLC选用粒径低于2 μm的小颗粒作为填料,比普通HPLC有更高的分离度､灵敏度和分析速度,因此对分离测定植物样品中的4种激素具有较大的优势｡本实验选用ACQUIY UPLC BEH130 C18 1.7 μm(2.1×100 mm)､ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)和ACQUIY UPLC BEH C18 1.7 μm(2.1×50 mm)分别对样品进行分离测定,结果显示用ACQUIY UPLC BEH C8 1.7 μm(2.1×50 mm)能够对样品进行很好的分离｡2.2.2 波长的选择将4种激素的混合标准溶液于ACQUITY超高效液相色谱系统上进行测定,PDA紫外检测器对其进行光谱扫描,最大吸收光谱的波长分别为:玉米素(ZT)在204 nm和271 nm有吸收峰,赤霉素(GA)在192 nm和252 nm有吸收峰,吲哚乙酸(IAA)在218 nm和279 nm有吸收峰,脱落酸(ABA)在194 nm和261 nm有吸收峰｡将4种激素的混合标准液分别在以上多个波长下进行测定,发现在波长为262 nm下标准混合液出峰基线毛刺少且峰形较好,玉米素､吲哚乙酸和脱落酸的峰面积为最高,赤霉素峰面积也变化较少,所以本实验采用262 nm为4种激素的检测波长｡4种激素的吸收光谱图见图1｡2.2.3 流动相的选择根据4种激素的特性及植物样品所含的杂质量,通过对各种流动相如甲醇-水､乙腈-水､甲醇-乙酸-水､乙腈-乙酸-水等不同溶液系统的尝试,最终选用甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液为流动相｡经反复试验后,发现甲醇和0.1%冰乙酸-水溶液在梯度洗脱的条件下,各组分分离较好,且各峰峰型较好,分析时间也较短｡4种激素保留时间合适,色谱图见图2;流动相比例见表1｡2.3 线性关系以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,将所得数据绘成标准曲线,玉米素线性方程为:Y=593.810X-43.469,R2=0.999 5,线性范围0.14~0.38 μg/mL;赤霉素线性方程为:Y=48.948X-19.105,R2=0.999 3,线性范围0.67 ~1.79 μg/mL;吲哚乙酸线性方程为:Y=315.500X-43.471,R2=0.999 6,线性范围0.25~0.67 μg/mL;脱落酸线性方程为:Y=6 481.000X-136.610,R2=0.999 9,线性范围0.036~0.096 μg/mL｡结果见图3-图6｡2.4 精密度试验精密吸取玉米素､赤霉素､脱落酸和吲哚乙酸混合标准溶液各5.0 μL,重复进样5次,测定峰面积,玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液峰面积的RSD分别为0.39%､0.47%､0.29%､0.25%｡表明方法精密度良好｡2.5 重复性试验同一批柑橘样品取样5份,按1.2.4操作,依法测定,计算玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸的含量,RSD分别为3.64%､2.48%､2.78%､3.15%｡表明方法重复性良好｡2.6 回收率试验称取已知含量的样品9份,加入玉米素､赤霉素､吲哚乙酸和脱落酸标准溶液5.0､7.5､10.0 mL各3份,按1.2.4进行操作测定,计算回收率,结果(表2-表5)表明,回收率在98.6%~99.1%,RSD在0.61%~0.99%,表明方法回收率较好｡3 小结与讨论以80%甲醇为提取剂,冰水浴超声提取45 min,C18柱净化为最佳实验条件,甲醇和0.1%冰乙酸为流动相,流速0.22 mL/min梯度洗脱,UPLC系统对样品进行测定,样品中4种激素能在7 min之内达到较好的分离｡充分利用了超高效液相色谱的优点与有利条件,建立的方法简单可靠,进一步拓宽了液相色谱在植物激素测定方面的应用｡参考文献:[1] 刘贤明,梁锦添,秦绪雄.用高效液相色谱分析植物内源激素吲哚-3-乙酸､脱落酸和玉米素[J].色谱,1996,8(1):340-341.[2] 陈小鹏,王秀峰,孙小镭,等.高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].山东农业科学,2005(1):65-67.[3] 郑春霞,王强,阮晓.HPLC分离测定香梨三种植物激素[J].新疆农业大学学报,2000,23(1):54-56.[4] 陈波浪,郑春霞,盛建东,等. HPLC分离和测定棉花中3种植物激素[J].新疆农业大学学报,2006,29(1):28-30.。
液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素
。因 此， 内源性类固醇激素的检
测及判定是近年来研究的热点。 , , 内源性类固醇是自身合成的激素， 包括睾酮、 表
收稿日期： !""( ,"# ,$) 第一作者： 王萌烨， 硕士研究生 * -,."/) ："$*#"’( + 0$1"#* 21$* 3#*
通讯联系人： 沈 , 敏， 研究员 * 42) ： （ "!$ ） *!)%$$’# ，-,."/) ：./#562#5071 + 6(8."/)* 3(.* 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ +(* !""’(*")( ） *
尿样经葡萄糖醛酸甙酶酶解后进行液液提取以甲醇后尿液中内源性类固醇激素的变化情况结果表明该方法样品处理简便色谱分离完全结果准确可靠可替代气相色谱谱法用于体液中内源性类固醇激素兴奋剂的常规分析
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色
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睾 酮、脱 氢 表 雄 酮（ 126&1%(2N/"#1%(582%(#2 ， ?@-A ） 、 雄酮以及苯胆烷醇酮等。其中 ?@-A 是多 种类固醇激素的重 要 前 体， 它在体内可通过多种途 径代谢为雄酮、 苯胆 烷 醇 酮 以 及 睾 酮 等 不 同 的 内 源
)］ 性类固醇 激 素［4;* ］ 务［ "" ， 。
! ! 本文 对 尿 样 先 用 葡 萄 糖 醛 酸 甙 酶 酶 解 后 采 用 液 ! 液提 取 法 提 取， 以 甲 基 睾 酮 为 内 标， 建立了尿液 中 ’()* 、 睾酮、 雄 酮、 苯胆烷醇酮和表睾酮等 $ 种 内源性类固醇的 +#!%& $ %& 分析 方 法， 并应用该方 法 测 定 了 健 康 受 试 者 服 用 ’()* 片 剂 后 尿 液 中 ’()* 等 $ 种内源性类固醇激素的含量。
免疫法测定内源激素
内源激素测定方法1、内源激素测定种类：生长素（IAA），细胞分裂素（CTK）测定玉米素核苷（ZR）和二氢玉米素核苷（DHZR）两类，赤霉酸（GA3），脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）。
2、免疫法测定，试剂盒购自北京农业大学化控研究室。
3、试剂1）包被缓冲液：称取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用量筒加1000ml蒸馏水，pH为9.6。
2）磷酸缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000ml 蒸馏水，pH为7.5。
3）样品稀释液：100ml PBS 中加0.1ml Tween-20，0.1g 明胶（稍加热溶解）。
4）底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸），18.43g Na2HPO4·12H2O，溶解定容至1000ml，再加1ml Tween-20，pH为5.0。
5）洗涤液：PBS加1ml Tween-20。
6）终止液：2mol/L H2SO4。
7）提取液：80%甲醇，内含1mmol/L BHT （二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的浓度）。
8）激素包被抗原、各激素抗体和标准物。
9）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体。
4、样品中激素的提取1）称取0.5—1g 新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），分三次加入3ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，摇匀后放置在4℃冰箱中。
2）4℃下提取4h，1000g 离心15min，取上清液。
沉淀中加1ml 提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液，残渣弃去。
3）上清液过C-18固相萃取柱。
具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。
不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析
犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１３６犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀吴元奇，冷亦峰，夏超，周树峰，兰海．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析．草业学报，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ，ＸＩＡＣｈａｏ，ＺＨＯＵＳｈｕ Ｆｅｎｇ，ＬＡＮＨａｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｍａｉｚｅｓｅｅｄｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１２）：２１３ ２１９．不同休眠玉米种子内源激素的含量测定和分析吴元奇１，冷亦峰２，夏超１，周树峰１，兰海１（１．四川农业大学玉米研究所，农业部西南玉米生物学与遗传育种重点实验室，四川成都６１１１３０；２．四川省农业科学院作物所，四川成都６１００６６）摘要：本研究利用高效液相色谱法，对７个不同休眠性的玉米自交系鲜种子内源激素ＺＴ、ＧＡ３、ＩＡＡ和ＡＢＡ的含量进行了测定和分析。
分析了各种激素及其相互作用对玉米种子休眠的影响，为阐明玉米种子休眠机理奠定了基础。
结果表明，ＺＴ含量在一定程度上与种子休眠性呈负相关性，具有对种子萌发抑制物的拮抗作用；ＧＡ３具有解除休眠和促进萌发的功能，在种子萌发过程中是必需的；ＩＡＡ与休眠不具有相关性；ＡＢＡ具有拮抗ＧＡ３的作用，诱导种子休眠，抑制萌发。
种子的休眠是几种激素综合作用的结果，种子休眠程度与种子内起促进作用和起抑制作用的激素之间的比例密切相关。
强休眠特性玉米自交系具有以下特征：ＺＴ和ＧＡ３含量低，ＡＢＡ含量高，ＺＴ／ＡＢＡ值与ＧＡ３／ＡＢＡ值较小，各激素相对平衡。
关键词：玉米；种子休眠；内源激素；高效液相色谱 犆狅犿狆犪狉犪狋犻狏犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犲狀犱狅犵犲狀狅狌狊犺狅狉犿狅狀犲狊犻狀犿犪犻狕犲狊犲犲犱狊狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狉犿犪狀犮狔犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊ＷＵＹｕａｎ Ｑｉ１，ＬＥＮＧＹｉ Ｆｅｎｇ２，ＸＩＡＣｈａｏ１，ＺＨＯＵＳｈｕＦｅｎｇ１，ＬＡＮＨａｉ１１．犕犪犻狕犲犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犅犻狅犾狅犵狔犪狀犱犌犲狀犲狋犻犮犐犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋狅犳犕犪犻狕犲犻狀犛狅狌狋犺狑犲狊狋犚犲犵犻狅狀，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犲狀犵犱狌６１１１３０，犆犺犻狀犪；２．犆狉狅狆犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犛犻犮犺狌犪狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻 犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犆犺犲狀犵犱狌６１００６６，犆犺犻狀犪犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｓｔｕｄｙｈａｓｂｅｅｎｕｎｄｅｒｔａｋｅｎｔｏｃｌａｒｉｆｙｍａｉｚｅｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒ ｍｏｎｅｓ ｚｅａｔｉｎ（ＺＴ），ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ（ＧＡ３），ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＩＡＡ）ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ（ＡＢＡ）ｉｎ７ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｄｉｖｅｒｓｅｄｏｒｍａｎｃｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｓｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｗｅａｎａｌｙｓｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｆｏｕｒｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓｏｎｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＺＴｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＧＡ３ｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃａｎｈｅｌｐｂｒｅａｋｄｏｒｍａｎｃｙ．ＩＡＡｈａｓｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙ．ＡＢＡｐｒｏｍｏｔｅｄｄｏｒｍａｎｃｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈａｎａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏＧＡ３．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅ ｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｕｒｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｄｏｒｍａｎｃｙｈａｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｉｔｓ：ｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔｏｆＺＴａｎｄＧＡ３，ｈｉｇｈｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡＢＡ，ｌｏｗｖａｌｕｅｓｏｆＺＴ／ＡＢＡａｎｄＧＡ３／ＡＢＡ，ａｎｄｂａｌａｎｃｅｄｈｏｒ ｍｏｎｅｃｏｎｔｅｎｔ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍａｉｚｅ（犣犲犪犿犪狔狊）；ｄｏｒｍａｎｃｙ；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＨＰＬＣ第２４卷 第１２期Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２草 业 学 报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ２０１５年１２月Ｄｅｃ，２０１５收稿日期：２０１５ ０３ １１；改回日期：２０１５ ０６ ２９基金项目：国家“８６３”计划（２０１１ＡＡ１０Ａ１０３）和四川省科技厅应用基础项目（２０１４ｊｙ００４８）资助。
HPLC测定内源激素
样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1—5个新梢的中部叶片4-6个，做好标记后存放于冰瓶中迅速带回实验室。
在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。
（1）激素的提取：称取0.1g由不少于4片叶子或其部分构成。
将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷已氰为浸提液，浸提3次，第一次加入5ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静置浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加入4ml，在振荡器上以230转/分钟速度振荡提取2小时（最好3小时）后离心，第三次加入2ml提取液清洗残渣，离心，8000rpm，10min，都倒入小玻璃瓶中。
（多提一次，第4次再加2ml）（2）第一次减压浓缩及溶解：将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入pH为8.0的0.4M磷酸缓冲液2ml和2ml三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。
用3ml0.4M磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏瓶，倒入小玻璃瓶中。
（3）去除色素：首先将盛有溶解液的玻璃瓶封口在4℃振荡器上振荡20min，而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去，然后加入2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。
如果水相中仍有色素可重复上一步进行第三次色素去除。
（一定要去干净色素）（4）去除酚类杂质：对三氯甲烷萃取的水相溶液（体积计数），倒入离心管，加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上下振荡，离心8000rpm，10min。
（5）植物激素的萃取：移液器取上清液3ml（10ml），滴加纯甲酸直pH试纸为3.0，（经验值130ul左右）往此水相中加入乙酸乙酯振荡（3ml），移液器提取脂相（上部），其水相用乙酸乙酯萃取两次（2ml，2ml），合并所得脂相。
（6）第二次浓缩及进一步纯化：所得到酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干。
高效液相色谱法快速分析植物内源性激素
高效液相色谱法快速分析植物内源性激素植物内源性激素在植物生长和发育过程中起着重要的调节作用。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为一种先进的分析技术，被广泛地用于植物内源性激素的定量分析和研究。
通过快速、准确地分析植物内源性激素，我们可以深入了解植物的生长和发育调控机制，为农业生产和植物育种提供重要的理论指导和实践应用。
一、植物内源性激素的概述植物内源性激素是一类在植物体内合成和调节生长发育的化合物，包括生长素、赤霉素、脱落酸、激素酮、保护素和亚硫酸氨基酸等。
它们在调节植物生长和发育过程中发挥着不可或缺的作用，如控制细胞分裂和伸长、调节根系和茎的形态发育、调控开花和果实发育等。
了解植物内源性激素的合成、分布和调控机制对于揭示植物的生长发育规律具有重要意义。
二、高效液相色谱法在植物内源性激素分析中的优势高效液相色谱法是一种在液相中进行分离和测定的分析技术，具有分离能力强、选择性好、分析速度快以及样品处理简单等优点，因此被广泛应用于植物内源性激素的定量分析中。
与传统的色谱方法相比，高效液相色谱法具有以下几个优势：1.分离能力强：高效液相色谱法能够有效地将混合样品中的激素物质分离出来，得到高纯度的化合物。
这一点对于复杂的植物组织和生理液体样品分析尤为重要。
2.选择性好：高效液相色谱法能够通过调整色谱柱、流动相和检测器等条件，实现对不同内源性激素的选择性分离和测定，从而提高了分析的准确性和可靠性。
3.分析速度快：高效液相色谱法具有快速分析的特点，一般可以在几分钟到几十分钟内完成一次分析，提高了实验效率。
4.样品处理简单：高效液相色谱法在样品处理时通常只需简单的提取和净化步骤，可以大大简化实验过程，提高了实验效率。
三、高效液相色谱法快速分析植物内源性激素的方法高效液相色谱法快速分析植物内源性激素的方法主要包括激素提取、净化和检测。
根据不同植物内源性激素的特性和含量，可以选择不同的样品处理方法和色谱条件。
高效液相色谱法分离和测定油茶茎尖组织中4种内源激素
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山东 农 业 科 学
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高 效液 相色谱法分离和测定油茶茎尖
组 织 中 ４种 内源 激 素
陈博 雯 ， 刘海 龙 ， 陈晓明 ， 蔡 玲 黄 金使 罩子 海 董 民利 ， ， ， ， 蒋 华
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UPLC-MSMS法同时检测人血清中5种微量内源性激素
UPLC-MS/MS 法同时检测人血清中5种微量内源性激素杨娜",刘紫薇2,王敏",朱怀军"，葛卫红卅1南京大学医学院附属鼓楼医院药学部，南京210008；"中国药科大学，南京210009摘要目的：建立一种快速、高效、同时检测人血清中睾酮（T ）、雄烯二酮（AD ）、脱氢表雄酮（DHEA ）、孕酮（P ）、17a -羟孕酮（17a -OHP ）浓度的UPLC-MS/MS 方法。
方法：血清样品采用 盐酸羟胺衍生化、以提高离子化效率，以同位素氘标记的P-d &作为内标，采用Agilent ZORBAXEclipse Plus Phenyl-Hexyl 色谱柱（2.1mm ! 100 mm ,3.5 甲酸水（A ）—乙腈（B ）为流动相,以0.3 mL - min -1流速梯度洗脱分离后，在电喷雾离子源正离子模式下扫描，分析时间5 min 。
结果：在0.05-100 ng-mL -1浓度范围内,5种激素呈现良好线性关系，定量下限均达到0.05 ng-mL -1，批内、批间精密度和准确度均符合要求，平均提取回收率和归一化基质因子变异均在15%以内。
结论：该方法成功用于实际血清样本中5种激素的定量分析。
关键词雄激素；孕激素；UPLC-MS/MS ；衍生化；方法学中图分类号 R927.11 文献标志码 A文章编号1673-7806（2021 ）01-019-04性激素检测是临床实验室检测项目中公认的 难题，主要原因是其在血液中含量极低（通常在pmol-L -"水平）〔"* **，且结构类似物众多叫因此对方法 的敏感度和特异度要求很高。
在现阶段临床检测中免疫法多用于性激素的检测；但由于其易受其他内源性类固醇、脂质和基质效应的干扰,对血清中微 量性激素测定的特异性和可靠性仍然存在疑惑。
*基金项目 江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20190122）作者简介 杨娜，女，主管药师 E-mail: **********************通讯作者 葛卫红，女，主任药师 E-mail: **************** 收稿日期 2020-06-03 修回日期 2020-10-12在性激素检测中,雄激素、孕激素的检测对于临床包括多囊卵巢综合征）+*、不孕症旳、高雄激素血 症冋等诸多疾病的诊断具有重要意义。
液相色谱梯度洗脱法检测石蒜组织中4种内源激素的方法
摘
要 ：针 对 石 蒜 组 织 材 料 富含 多酚 类 等 杂 质 的特 点 ，改 进 样 品 前 处 理 方 法 和 仪 器 检 测 条 件 ，建 立 了 适 用
于 石 蒜 组 织 中 ４种 植 物 内源 激 素 ＩＡ、Ａ Ａ、Ｚ Ａ Ｂ Ｔ和 Ｇ ， 分 析 方 法 。 通 过 实 际检 测 和 回收 率 实 验 表 明 ，该 改 进 Ａ 的 方 法 定 量 准 确 、能 适 应 复杂 基 质 干扰 等 特 点 。
嘲
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澎 学 矸 ２２第 期 江 学 ０年 ７ １
，
文 献著 录格 式 ：付 晓 陆 ，汪少 敏 ，徐 敏 ．液相 色谱 梯 度 洗 脱 法 检 测 石 蒜组 织 中 四种 内源 激 素 的 方 法 ［ ］ 浙 江农 业 科 学 Ｊ．
１２ ． ０ ２
２ １ （ ：１ ２ ０ ２ ７） ０ ０
２ ３ 方 法 回 收 率 实验 ．
通过 在 捣 碎 石 蒜 样 品 中添 加 ４种 内源 激 素 标 样 ，经过 １ ４样 品前 处 理 ： ． 过程 ，同时做 样 品空 白 ，
液 ｐ 调 至 ２９ Ｈ ． ，用 ３ ０ ｍＬ的 乙 酸 乙 酯 萃 取 ３次 ， 合并 酯 相 ，４ ０℃ 用 氮 吹仪 吹干 ，用 流 动 相 溶解 定
收稿 日期 ：２ １ －２ １ ０ ２０ ．５ 基金 项 目 ：２ １ ０ ０年 度 杭 州 市 科 技 发 展计 划 项 目
和 ３ ０ｍｇ・ｍ 抗 氧 化 剂 （ 乙基 二 硫 代 氨 基 甲 Ｌ 二
作者 简 介 ：付 晓 陆 （ ９４一） １７ ，男 ，湖 北 人 ，农 艺 师 ，硕 士 ，从 事 农 产 品 检 测 工作 。Ｅ ｍ ｉ ｆｘ ｏ ５ ＠ ｓｈ ．ｏ － ａｌ ｕ ｉ ｌ ９ ｏｕ ｃｒ ： ａｕ ｎ
高效液相色谱法在木本植物内源激素含量检测中的应用
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杨
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婕 ， 日清 ， 晓玲 张 金
（ 南 林 业科 技 大 学 ， 南 长 沙 ４ ０ ０ ） 中 湖 １ ０ ４
摘
要 ： 植 物 内 源激 素 与 植 物 基 因 的 表 达 、 长 发 育 的基 本 规 律 和 代 谢 调 控 等 密 切 相 关 。采 用 高 效 液相 色谱 法 分 析 生
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第２ ８卷
第１ 期
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２ １ 年 ３月 ００
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同 液相 色谱 法在 木本 植物 内源 激素 效 含 量检 测 中的应 用
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超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量
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湖 北 农 业 科 学
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超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性 内源激素的含量
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高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素
蚕豆中5种内源激素的高效液相色谱测定
蚕豆中5种内源激素的高效液相色谱测定王萌;张海惠;刘琪;张利【摘要】采用高效液相色谱法分离和测定蚕豆中的吲哚乙酸、激动素、赤霉素、脱落酸和玉米素5种植物内源激素.结果表明:选用80％甲醇作为样品提取溶剂,经石油醚和乙酸乙酯萃取,采用Diamonsil C18色谱柱进行分离,以甲醇∶0.075％冰乙酸(45∶55;V/V)溶液为流动相,流速0.7 mL/min,波长254nm的检测条件下,蚕豆中各激素的分离效果理想,25 min内全部出峰,加样回收率达88.9％～97.3％.经测定蚕豆中吲哚乙酸、激动素、赤霉素、脱落酸和玉米素质量分数分别为15.2、35.0、332.9、2.4、9.23 ng/g,该方法满足激素定量分析的要求,能快速、准确的测定蚕豆内源激素.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2015(050)006【总页数】4页(P58-61)【关键词】蚕豆;高效液相色谱;内源激素【作者】王萌;张海惠;刘琪;张利【作者单位】四川农业大学,四川雅安625014;四川农业大学,四川雅安625014;四川农业大学,四川雅安625014;四川农业大学,四川雅安625014【正文语种】中文【中图分类】S643.6第一作者：王萌(1985-)，女，讲师，博士，研究方向为植物资源的评价与利用.E-mail:********************蚕豆(Viciafaba)属于豆科，营养丰富，用途广泛，是中国重要的粮食、蔬菜、副食、饲料和养地作物，如何调控其生长发育，进而提高其产量与品质近年来备受关注.植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等活动起着间接或直接的调节、控制作用[1].目前，国内对豆类作物的研究主要集中在矿质元素、氨基酸、蛋白质等营养成份，对于内源激素的研究比较少，而关于蚕豆的相关研究更为少见[2].植物内源激素含量低，性质不稳定，加之细胞中其他化合物的干扰，故测定方法必须十分灵敏和专一[3].目前植物内源激素的检测主要有生物鉴定法[4]、气相色谱法[5]、酶联免疫法[6]、光谱测定法[7]、放射免疫法[8]和高效液相色谱法(HPLC)[9]等.HPLC法具有灵敏度高、专一性强、重复性好等特点，除了乙烯外，其它内源激素均可以用HPLC法进行检测，且可以实现几种激素的同时测定，应用最为广泛.因此，本研究拟采用HPLC法针对蚕豆中的吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)5种内源激素进行检测分析，旨在为蚕豆品质提高、性状改良及开发利用提供一定的理论依据.1.1 试验材料试验用蚕豆种植于四川农业大学生命科学学院植物园中，挑选生长健壮的蚕豆植株，取叶片后置于-20 ℃冰箱中保存备用.1.2 仪器与试剂LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RM-220超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT124s电子天平.吲哚乙酸、激动素标准品(成都科龙化工试剂厂，纯度≥99.0%)；赤霉素标准品(Sigma公司，纯度≥99.0%)；脱落酸标准品(上海蓝季科技发展有限公司，纯度≥99.0%)；玉米素标准品(上海生物科技有限公司，纯度≥99.0%)；石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；试验用水为超纯水.所以试剂在使用前均用0.45 μm微孔滤膜过滤.1.3 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.075% 冰乙酸水溶液(体积比45∶55)等度洗脱，紫外检测波长254 nm，柱温20 ℃，流速0.7 mL/min，进样量10 μL.1.4 标准溶液的配制精密称取IAA 1.10 mg、KT 1.22 mg、ABA 0.56 mg、ZT 1.06 mg，均用80%甲醇溶液溶解标准品定容于10.00 mL，GA34.44 mg定容于25.00 mL的容量瓶中，摇匀.分别从中精密吸取IAA 1.00 mL、KT 5.00 mL、GA310.00 mL、ABA 1.00 mL、ZT 1.00 mL置于25.00 mL的棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制IAA 4.40 μg/mL、KT 24.4 μg/mL、GA371.4 μg/mL、ABA 2.24 μg/mL、ZT 4.24 μg/mL的混合标准溶液.避光4℃下存放备用.1.5 样品前处理样品前处理参照王世平等的方法并加以改进与优化[10].准确称取5.0 g蚕豆叶片，加入50 mL预冷的80%甲醇，冰浴研磨成浆，4 ℃避光冷浸过夜.抽滤后得上清液，残渣再用80%甲醇提取2次(40 mL、20 mL各2 h)，合并上清液，40 ℃下旋转减压浓缩至干.分别用10 mL的磷酸缓冲液(pH=8.0)和10 mL的石油醚冲洗蒸馏瓶，合并冲洗液抽滤后，滤液用2倍体积的石油醚萃取3次，弃醚相.水相调整pH=8，等体积乙酸乙酯萃取3次，取酯相并调水相pH至8后等体积乙酸乙酯萃取3次，合并所有酯相40 ℃减压浓缩至干，用80%甲醇溶解残留物并定容至10mL，0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析.2.1 色谱条件优选2.1.1 流动相的确定利用高效液相色谱测定植物细胞内源激素含量，由于所用色谱柱的种类不同，中所用的流动相种类差别较大.常用的流动相有甲醇-0.6%乙酸梯度洗脱[11]；乙腈-甲醇-0.6 %乙酸( 5∶50∶45，V/V)[12]；甲醇-水-乙酸(50∶45∶5，V/V)[13]；甲醇-乙腈-磷酸(15∶15∶70，V/V)[14]；乙腈-10mmol/L乙酸钠(20∶80，V/V)[15]，乙腈-0.02 mol/L醋酸缓冲液(25∶75，V/V)[16].通过综合比较上述各种流动相经过Diamonsil C18色谱柱对蚕豆5种内源激素分离效果，优化后发现用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液为流动相时，分离效果最好，且在25 min内全部出峰.2.1.2 流速的确定分离时间随流速的变化而变化，流速越大，各组分被洗脱出来时间就越短，即每分析一个样品所耗时间越短，但流速太快，也会影响各组分的分离效果.基于流速要使各组分吸收峰能完全分离而又保留时间相对较短，在流动相、柱温、检测器波长等条件一定的情况下，使用等度洗脱分别考察了流速为0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min时的分离效果，最终确定最佳流速选用0.7mL/min.2.1.3 波长的确定检测波长是影响液相色谱检测结果的一个重要因素.首先对GA3和ABA标准液在紫外检测器下进行扫描，确定其吸收波长范围，为液相色谱检测波长的选择提供依据.检测结果显示GA3最大吸收波长为253 nm，ABA 最大吸收波长为257 nm.而对ZT、IAA、KT的甲醇溶液均在250～270 nm之间有最大响应，综合分析，考虑到UV-检测器在254 nm处灵敏度最高，本试验选用254 nm作为5种内源激素的检测波长，检测效果最佳.2.2 线性关系考察根据色谱条件，精密吸取5种激素的混合对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL依次进样，测定其峰面积(图1).以进样量x为横坐标，色谱峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，分别得5种激素回归方程、保留时间、相关系数、线性范围列于表1，表明5种激素在相应的范围内线性关系良好.2.3 方法学考察2.3.1 精密度试验分别精密吸取同一混合供试品溶液10 μL，连续进样5次，结果得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分别为0.16%、0.5%、1.1%、3.9%、0.5%.2.3.2 稳定性试验取冷暗处放置的同一份供试品溶液，在同样色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12 h分别进样分析，每次10 μL测定色谱峰面积，IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分别为3.9%、0.7%、0.7%、3.1%、0.6%，结果显示溶液在12 h内较稳定.2.3.3 重复性试验精密称取同一份样品5份，按照1.5项制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样10 μL，进行含量测定.结果测得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的平均质量分数RSD分别为1.0%、1.4%、4.8%、2.0%、0.7%，表明该方法重现性较好.2.3.4 回收率试验采用加样回收法，准确称取已知5种内源激素含量的蚕豆叶片5份，每份5.000 g，每份样品中均吸取1 mL IAA 0.052 μg/mL、KT 0.188μg/mL、GA30.977 μg/mL、ABA 0.018 μg/mL和ZT 0.042 μg/mL的标准品溶液，按照1.5项下方法进行供试品制备，在上述色谱条件下，进样10 μL进行含量测定，重复3次计算回收率，其测定结果及RSD值参见表2.2.4 样品测定分别精密吸取对照品与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行色谱分析.平行测定3次，采用外标法计算蚕豆叶片中IAA、KT、GA3、ABA、ZT的含量，含量结果及RSD值见表3，HPLC色谱图见图2.本试验通过优化蚕豆中5种内源激素的提取条件及色谱条件，建立了一种简单、有效的运用HPLC同时检测蚕豆中5种内源激素的分析方法.选用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液为流动相，检测波长254 nm，流速0.7 mL/min时分离效果理想，加样回收率达88.9 %～97.3 %.该方法满足激素定量分析的测定要求，为进一步检查蚕豆生长发育过程中内源激素的变化、激素代谢等相关研究提供了关键技术.【相关文献】[1] 张玉琼，仲延龙，高翠云，等.高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素[J].色谱,2013,31(8):800-803[2] 贾宏涛，郑春霞，陈波浪，等.豆类激素与矿质元素、氨基酸、蛋白质含量的相关性研究[J].大豆科学,2010,29(6):1047-1051[3] 黄晓荣，张平治，吴新杰，等.植物内源激素测定方法研究进展[J].中国农学通报,2009,25(11):4-87[4] 丁静，沈镇德.植物内源激素的提取分离和生物鉴定[J].植物生理学通讯,1979(2):27-39[5] 杜黎明，许庆琴.气相色谱法分离和测定3 种植物内源激素[J].色谱,2000,18(1):67-69[6] 李宗霆，周燮.植物激素及其免疫检测技术[M].南京：江苏科学技术出版社，1996[7] Lin X,Ma L,Lin Y W,et al.Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection [J].Journal of Chromatography A,2003,1021(1-2):209-213[8] Aar G,Türker M,B P,et al.Phytohormone levels in germinating seeds ofZeamaysL exposed to selenium and aflatoxines [J].Ecotoxicology,2006.15:443-450[9] 程建新，毕阳，田世龙，等.高效液相色谱法同时测定马铃薯块茎中的GA3、IAA和ABA含量[J].甘肃农业大学学报,2013,48(2):26-29[10] 王世平，阮小凤.四种植物激素的分离与纯化[J].植物生理学通讯,1987,(5):48-51[11] 张有林，党娅.高效液相色谱法同时测定银凤桃中的赤霉素和脱落酸[J].西北植物学报,2005,25(7):1467-1471[12] 谢君，张义正.植物内源激素的反相高效液相色谱法测定[J].分析测试学报,2001,20(1):60-62[13] 胡佩，杨红.高效液相色谱法测定蚓粪中的植物激素[J].分析试验室,2001,20(6):8-10[14] 曾庆钱，陈厚彬，等.HPLC测定荔枝不同器官中内源激素流程的优化[J].果树学报,2006,23(1):145-148[15] 符继红，褚金芳，王吉德，等.固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中的生长素[J].分析化学,2009,37(9):1324-1327[16] 陈昆松，许昌杰.HPLC法检测果实组织中内源IAA、ABA方法的改进[J].果树学报,2003,20(1):4-7。
内源激素测定方法
内源激素的提取、纯化和测定各时期取强、弱势粒置液氮中冷冻后于-80 ℃冰箱中保存，用于GA3、Z、ZR、IAA、ABA的提取和测定。
激素的提取和纯化参照陈远平[84]的方法并稍加改进，具体如下：0.5－1.0 g （叶片为1.0 g，籽粒为0.5 g）↓80 %甲醇约4+4+4+4ml（4ml磨，12ml洗）冰上研磨成匀浆↓4 ℃浸提12 h4 ℃5000 rpm离心15 min↓上清液，50ml离心管冰箱保存（F0650，6个）沉淀↓+80 %甲醇约10 ml （1）4 ℃5000 rpm离心15 min↓沉淀重复（1）↓合并上清液于50ml离心管（20+10+10ml）↓ 36 ℃旋转蒸发浓缩至5 ml-10 ml[约用1ml80%甲醇冲洗残余至浓缩瓶中][转速在173-193左右，吸附在壁上为止][温度32以上时拔掉插头]↓超纯水水洗2次，每次3 ml，简单震荡，合并↓0.1 g PVPP，4 ℃冰浴振荡1 h-70 ℃冰箱，完全冻结↓4 ℃冰箱融化↓4 ℃10000 rpm离心15 min上清液↓冷阱冷冻干燥（超低温冰箱预冻2h）1ml甲醇溶解，1ml甲醇润洗↓5 ml 100%甲醇活化C18小柱↓5 ml 80% （v/v）甲醇平衡，弃去用于活化和平衡的甲醇↓样品洗液过Sep-Pak C18小柱↓用5 ml 100%甲醇洗脱↓收集过柱液样品液和洗脱液分别浓缩至干，上机前用流动相1ml溶解↓0.45 μm微孔滤膜过滤10 μl进样以上处理都在弱光下进行。
激素测定采用高效液相色谱法（HPLC）。
色谱条件：Dubhe C18 4.6×250，5 μm，流动相：乙氰-甲醇- 0.6 % 乙酸（体积比5:50:45），流速：1.0 ml min-1，梯度洗脱见表1，检测波长254 nm；柱温30 ℃，进样量10 μl。
样品回收率为96.5±2.6%，每一个样品至少重复4次。
外标法定量。
超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素
收稿日期:2020-03-02 修回日期:2020-06-24基金项目:中央高校基本业务费实验技术人才基金(N o .K J S Y 201710) *通讯作者:卢亚萍,女,副教授,主要从事生物技术㊁色-质技术应用等方面的研究.E -m a i l :l y p h w q @n ja u .e d u .c n 第37卷第1期V o l .37 N o .1分析科学学报J O U R N A LO FA N A L Y T I C A LS C I E N C E2021年2月F e b .2021D O I :10.13526/j.i s s n .1006-6144.2021.01.014超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素汪 瑾,戴 琳,王安琦,卢亚萍*(南京农业大学生命科学学院生命科学实验中心,江苏南京210095)摘 要:建立一种利用超高效液相色谱-飞行时间-质谱(U P L C -T O F -M S )快速高效地对植物激素进行定性定量测定的方法㊂对植物中常见的异戊烯腺嘌呤㊁玉米素㊁玉米素核苷㊁独脚金内酯㊁茉莉酸甲酯㊁脱落酸㊁赤霉酸㊁吲哚乙酸㊁茉莉酸和水杨酸10种内源激素,利用一级质谱全扫描㊁二级质谱及多反应检测模式对其进行测定,确定其检测限和定量限;采用不同的溶剂(异丙醇㊁丙酮㊁甲醇㊁乙腈)提取水稻㊁小麦㊁烟草㊁番茄等植物样品,利用固相萃取小柱从植物基质中回收激素标品,测定其回收率和精密度㊂结果表明,10种激素在质谱上均有良好的响应,浓度和响应值的线性相关性均达到0.99以上;固相萃取小柱对200㊁50n g /m L 激素的回收率均达到90%以上,对10n g/m L 激素的回收率在80%左右;乙腈+1%甲酸的提取效果最好;采用80%甲醇复溶可以更有效地回收激素㊂本方法简单㊁快速㊁重现性好,可用于同时测定多种植物内源激素㊂关键词:高分辨质谱;植物激素;定量测定中图分类号:O 657.63 文献标识码:A 文章编号:1006-6144(2021)01-081-07植物激素是一类小分子化合物,参与植物的抗生物和非生物胁迫[1,2]㊂植物激素通常分为六大类,包括生长素㊁赤霉素㊁细胞分裂素㊁脱落酸㊁乙烯和油菜素甾醇[3]㊂植物激素一般是极低浓度的植物内源物质,需要使用合适的方法来提取富集㊂用于分析植物激素的样品制备过程,包括采样㊁提取㊁纯化和浓缩,己成为快速分离以及痕量植物激素超灵敏分析的一个瓶颈[4]㊂植物组织中植物激素的浓度和分布受温度㊁水情㊁空气湿度和光照强度等条件的影响[5]㊂因此,从植物中分离组织后,需要立即将收集的新鲜组织冻结在液氮中㊂然后选取合适的提取溶剂,理想的提取溶剂能够高效率地从样品中提取尽量多种类的植物激素㊂用于激素提取的溶剂包括甲醇㊁乙腈㊁丙酮㊁异丙醇等[6]㊂样品前处理对实验结果产生很大的影响[7]㊂前处理技术,包括液-液萃取㊁固相萃取㊁分子印迹萃取㊁免疫亲和纯化等,现已被用于从粗提物中进一步纯化痕量植物激素[8]㊂检测技术一般包括生物测定法㊁免疫测定法㊁电分析法㊁色谱法以及质谱法[9-12]㊂色谱和质谱联用技术具有强分离能力,高灵敏性㊁选择性和准确性,已成为激素测定的强有力的工具㊂因此,液相色谱-四极杆飞行时间-质谱(L C -qT O F -M S )方法现已被用于测定痕量植物激素[13-15]㊂本研究的目的在于建立一种利用L C -qT O F -M S 测定植物中常见的内源激素(赤霉素㊁脱落酸㊁细胞分裂素㊁茉莉酸㊁水杨酸)的快速高效的方法,为激素的功能㊁相互作用等研究奠定基础㊂1 实验部分1.1 仪器与试剂W a t e r sG 2-X SQ -T O F 质谱仪(美国,W a t e r s 公司),配有电喷雾(E S I )离子源;S pe e d V a c 真空离心浓缩仪(美国,T h e r m oF i s h e r 公司)㊂第1期汪瑾等:超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素第37卷10种植物激素标准品(纯度均>97%):脱落酸(A B A)㊁赤霉酸(G A)㊁茉莉酸(J A)㊁水杨酸(S A)㊁茉莉酸甲酯(M J)㊁吲哚乙酸(I A A)㊁异戊烯腺嘌呤(I P)㊁玉米素(Z T)㊁玉米素核苷(Z R)㊁独脚金内酯(S L),均购自上海源叶生物科技有限公司㊂将10种标准品用甲醇溶解,配制成浓度为1m g/m L的母液,使用时稀释㊂甲醇㊁乙腈㊁丙酮㊁甲酸和N H4A c为色谱纯,购自M e r c k M i l l i p o r e公司;其他试剂为国产分析纯㊂小麦㊁水稻㊁烟草㊁棉花㊁番茄㊁拟南芥来自江苏农科院种质资源与生物技术研究所,温室培养㊂1.2样品提取取幼苗期的各种植物材料,用液氮研磨破碎后,称取100m g,分别加入1m L不同的样品提取液(1:66.7%异丙醇+1%甲酸;2:80%丙酮+1%甲酸;3:80%甲醇+1%甲酸;4:乙腈;5:乙腈+1%甲酸),超声提取60m i n,13000r/m i n离心10m i n,收集上清液㊂沉淀中再加入0.5m L样品提取液振荡10m i n,13000r/m i n离心10m i n,收集上清液㊂合并两次上清液,用真空离心浓缩仪挥干后,重新溶解于含0.1%甲酸甲醇中㊂1.3固相萃取用1m L纯甲醇淋洗固相萃取小柱两次,再用1m L0.1%甲酸淋洗柱子两次㊂将10%甲醇(含0.1%甲酸)溶解的样品加入到柱子里,用1m L0.1%甲酸淋洗柱子,最后用1m L80%甲醇(含0.1%甲酸)洗脱两次㊂洗脱后的组分用真空离心浓缩仪挥干,复溶于0.2m L80%甲醇(含0.1%甲酸)中,待测㊂1.4液相色谱-质谱检测条件色谱条件:色谱柱:U P L C B E H C18柱(100ˑ2.1m m,1.7μm;美国W a t e r s公司);流动相A为0.1%甲酸+2m m o l/LN H4A c(正离子),或2m m o l/L N H4A c(负离子);流动相B为甲醇㊂洗脱条件如下:0~11m i n,5%~95%B;95%B淋洗柱子,然后恢复到起始组分5%B㊂进样量2μL;柱温35ħ㊂质谱条件:毛细管电压:3.0k V;锥孔电压:40V;源温度:120ħ;脱溶剂温度:400ħ;碰撞能量:10~ 50e V;比扫描范围:m/z50~1000;亮氨酸脑啡肽(L E)用于质量校正㊂1.5数据分析质谱数据采集和分析使用W a t e r sM a s s l y n x4.1软件㊂实验数据为三次重复平均值,表示为平均数值ʃ标准偏差(S D)㊂采用S t u d e n t T检验对实验数据进行比较,当p<0.05时,认为有显著性差异;当p<0.01时,认为差异极为显著;当p>0.05时认为没有显著性差异㊂2结果与讨论2.1色谱条件的选择及优化色谱柱及流动相的选择会对化合物的分离度和峰形产生重要的影响[19,20]㊂液相色谱-质谱分析中,有机流动相一般采用乙腈或甲醇,同时也会添加一定量的酸和盐以提高离子化效率㊁改善峰形㊂本研究比较了乙腈和甲醇的分离效果,发现两者没有显著差异,于是选择了毒性较小㊁成本较低的甲醇作为有机相㊂同时在正离子模式下,流动相A(d d H2O)中添加了0.1%的甲酸及2m m o l/L的N H4A c,负离子模式下流动相A中添加了2m m o l/L的N H4A c,达到了良好的离子化效率和分离效果㊂2.210种常见植物内源激素的定性分析在M S/M S采集模式下,对10种化合物进行一级全扫描和二级碎片检测㊂正离子模式下,I A A㊁I P㊁Z R㊁Z T㊁S L和M J有较好的响应度,而A B A㊁G A3㊁J A和S A在负离子模式下响应度较好,提取离子色谱图如图1㊁图2㊂在M S/M S模式下,以[M+H]+或[M-H]–离子为母离子得到二级碎片离子的质谱信息列于表1㊂选择丰度相对较高的子离子作为特征碎片离子,各物质的一级㊁二级色谱图㊁质谱图及结构信息如图3㊁图4㊂2.310种植物内源激素的定量测定将10种激素标准品溶液稀释为0.1㊁0.2㊁0.5㊁1.0㊁2.0㊁5.0㊁10.0㊁20.0㊁50.0㊁100.0n g/m L,对每个梯度的样品进行质谱测定,采集模式为M S㊁M S/M S或M R M㊂采用不同的采集模式时,各种激素的响应度不同,其中M S的响应度最高,而M S/M S及M R M模式下的响应度会降低1~2个数量级㊂因此采用M S模式对各种激素进行定量测定,制作标准曲线,确定其检测限(L O D)和定量限(L O Q),测定结果列于表2㊂所有的激素样品在稀释浓度范围内具有较好的线性关系,相关系数R2达到0.99以上㊂每种样品检第1期分析科学学报第37卷测限和定量限相差很大,其中I P,Z R定量限为0.1n g/m L,是所测激素中质谱响应度最高的㊂图1正离子模式下6种植物激素的提取离子色谱图F i g.1E x t r a c t i o n i o n c h r o m a t o g r a m s o f s i x p l a n t h o r m o n e s i n p o s i t i v e i o nm o d e图2负离子模式下4种植物激素的提取离子色谱图F i g.2E x t r a c t i o n i o n c h r o m a t o g r a m s o f f o u r p l a n t h o r m o n e s i nn e g a t i v e i o nm o d e图3正离子模式下6种植物激素的一级㊁二级质谱图及碎片结构信息F i g.3M S,M S/M S a n d s t r u c t u r e e l u c i d a t i o no f s i x p l a n t h o r m o n e s i n p o s i t i v e i o nm o d e第1期汪瑾等:超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素第37卷表110种植物激素的质谱信息T a b l e1M a s s s p e c t r o m e t r i c i n f o r m a t i o no f t e n p l a n t h o r m o n e sA b b r e v i a t i o n C o m p o u n d F o r m u l a I o nm o d e P a r e n t i o n(m i n)(m/z)R e t e n t i o n t i m e(m/z)D a u g h t e r i o nI A A I n d o l e a c e t i c a c i d C10H9N O2[M+H]+176.0712130.06576.06I P I s o p e n t e n e a d e n i n e C10H13N5[M+H]+204.1249136.06325.80Z R R i b o s y l z e a t i n C15H21N5O5[M+H]+352.1621220.11884.54Z T Z e a t i n C10H13N5O[M+H]+220.1198136.06123.41S L S t r i g o l a c t o n e C17H14O5[M+H]+299.0919157.06388.01M J M e t h y l j a s m o n a t e C13H20O3[M+H]+225.1491151.1128.81A B A A b s c i s i c a c i d C15H20O4[M-H]-263.1283153.0925.14G A3G i b b e r e l l i c a c i d C19H22O6[M-H]-345.1338143.08684.62J A J a s m o n i c a c i d C12H18O3[M-H]-209.1178149.09715.71S A S a l i c y l i c a c i d C7H6O3[M-H]-137.023993.09563.02图4负离子模式下4种植物激素的一级㊁二级质谱图及碎片结构信息F i g.4M S,M S/M S a n d s t r u c t u r e e l u c i d a t i o no f f o u r p l a n t h o r m o n e s i nn e g a t i v e i o nm o d e表210种激素的定量参数T a b l e2T h e q u a n t i t a t i v e p a r a m e t e r o f t h e t e nh o r m o n e sA n a l y t e L i n e a r e q u a t i o n R2R S D(%)L O D(n g/m L)L O Q(n g/m L)I A A y=21.22x-3.4990.9983.9510I P y=453.3x+7.9890.9992.10.050.1Z R y=101.8x+191.30.9994.20.050.1Z T y=274.0x-170.10.9995.315S L y=18.47x+7.6630.9983.6510M J y=129.7x+125.60.9993.50.15A B A y=23.75x+54.370.9995.125G A3y=31.31x+72.430.9993.715J A y=27.11x+118.70.9964.125S A y=33.63x+141.80.9972.825y:P e a ka r e a;x:M a s s c o n c e n t r a t i o n,n g/m L.2.410种植物激素添加回收实验选用目标植物激素含量低于检测限的植物样品作为空白基质,分别加入3个浓度(10㊁50㊁200n g/m L)的激素标品混合物,通过W a t e r sH L B固相萃取小柱回收后,测定回收前后的质谱响应值,计算测定浓度及回收率,测定结果见表3㊂对于浓度为200㊁50n g/m L激素样品,回收率可达到90%以上;而对于浓度为第1期分析科学学报第37卷10n g/m L 的样品,回收率偏低㊂其中S L 的回收率最低,为77.8%,Z T 的回收率最高,为92.6%㊂表3 10种植物激素的添加回收率和相对标准偏差(n =3)T a b l e 3 R e c o v e r i e s a n dR S D s o f t e n p l a n t gr o w t hh o r m o n e s (n =3)A n a l y t e 200n g/m L 50n g/m L 10n g/m L R e c o v e r y(%)R S D (%)R e c o v e r y(%)R S D (%)R e c o v e r y(%)R S D (%)I A A 96.12.5106.91.578.98.8I P95.01.495.92.190.813.2Z R 99.71.598.70.591.07.6Z T95.62.294.61.492.69.9S L 92.73.490.75.477.88.6M J103.24.4101.05.884.97.5A B A 97.81.398.02.288.910.6G A 395.42.793.11.791.27.0J A94.51.692.50.783.97.7S A98.40.994.40.785.28.52.5 不同的样品提取液和溶剂对激素提取效率的影响图5 5种不同提取液提取烟草激素的效果F i g .5 E x t r a c t i o ne f f e c t o f f i v ee x t r a c t i n g so l u t i o n i n t o b a c c o 选取5种试剂从烟草幼苗中提取激素㊂5种提取液分别是:(1)66.7%异丙醇+1%甲酸;(2)80%丙酮+1%甲酸;(3)80%甲醇+1%甲酸;(4)乙腈;(5)乙腈+1%甲酸㊂不同提取液的提取效果如图5㊂丙酮作为提取剂,提取液颜色很深,说明其中溶解了很多的叶绿素,会对后续的样品前处理和样品测定造成较大影响㊂异丙醇和乙腈的提取效果相对更好,而乙腈提取时I P 的响应值明显优于异丙醇㊂加入1%甲酸对乙腈的提取效果有更好的提高作用㊂对于烟草样品中含量较高的成分I P ㊁Z R ㊁Z T ㊁S A ,使用乙腈+1%甲酸作为提取液,提取效果明显优于其余几种提取液㊂为了考察不同的溶剂复溶对于激素溶解和测定的影响,将提取后的激素初提液旋转挥干后溶于20%~100%的甲醇中,通过L C -M S 测定其质谱响应值,结果见表4㊂对于I P ,Z T 和S A ,在80%甲醇中检测信号最强,而Z R 在100%甲醇中检测到的信号最强㊂100%甲醇溶解时溶液中叶绿素含量较高㊂综合考虑,选用80%的甲醇作为溶剂复溶激素提取物㊂表4 不同浓度甲醇复溶后几种激素的响应值T a b l e 4 R e s po n s e v a l u e s o f s e v e r a l h o r m o n e s a f t e r r e d i s s o l u t i o n i nm e t h a n o l a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s M e t h a n o l 20%40%60%80%100%I P881ʃ102898ʃ125934ʃ1421501ʃ2021301ʃ188Z R7567ʃ8647755ʃ9127980ʃ10019704ʃ89810293ʃ1221Z T75529ʃ644274840ʃ564777103ʃ824182556ʃ754172747ʃ9541S A266ʃ25328ʃ23404ʃ51563ʃ54382ʃ42在提取过程中,比较了振荡提取和超声提取的提取效果,以及提取时间对提取效果的影响㊂结果发现,超声提取的植物激素的量大于振荡提取,并且提取60m i n 可达最佳效果㊂在对样品粗提液进行浓缩干燥时,我们比较了使用氮吹仪和离心浓缩仪的效果㊂两种仪器的处理对于植物激素的影响程度没有显著区别,因此选择速度更快的真空离心浓缩仪作为处理仪器㊂实验还比较了汉邦C 18柱㊁安普C 18柱和MA X (阴离子交换吸附柱)的纯化效果,两种C 18柱的回收效果略低于O a s i sH L B 小柱,而MA X 柱在本实验中对于酸性化合物的回收效率并未显著高于H L B 小柱,因此选用H L B 柱作为标准品和植物样品的萃取柱㊂第1期汪瑾等:超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素第37卷2.6植物材料中激素的测定选取几种植物材料幼苗,按优化的提取及测定方法,通过高分辨率飞行时间-质谱,采用一级全扫描的方式测定其质谱响应值,并根据标准曲线计算各种激素的含量㊂从100m g水稻㊁小麦㊁烟草㊁棉花㊁番茄㊁拟南芥幼苗中,检测到了I A A㊁I P㊁Z R㊁Z T㊁A B A㊁G A3㊁J A㊁S A(表5),而S L和M J含量低于定量限,未检出㊂表5几种植物材料中植物激素的定量结果(n g/g F W)T a b l e5Q u a n t i t a t i o no f t h e h o r m o n e s i n s e v e r a l p l a n t s(n g/g F W)A n a l y t e R i c e W h e a t T o b a c c o C o t t o n T o m a t o A r a b i d o p s i sI A A50.2ʃ6.421.0ʃ3.315.6ʃ2.419.5ʃ2.429ʃ2.433.1ʃ2.4I P5.0ʃ0.98.8ʃ2.85.6ʃ1.215.1ʃ2.2N D71.4ʃ12.2Z R141.7ʃ8.085.0ʃ9.5108.9ʃ18.3110.9ʃ10.579.4ʃ9.487.0ʃ6.0Z T217.4ʃ14.2154.7ʃ16.531.5ʃ1.1163.9ʃ19.556.2ʃ3.49.7ʃ1.4A B A12.4ʃ3.124.4ʃ3.629.5ʃ3.738.3ʃ5.763.4ʃ1.814.4ʃ4.3G A37.1ʃ2.28.2ʃ2.930.1ʃ2.812.2ʃ2.128ʃ3.16.7ʃ1.8J A N D105.1ʃ13.0N D17.7ʃ1.27.8ʃ2.440.3ʃ9.0S A2526.8ʃ150.612.6ʃ5.586.0ʃ25.8390.5ʃ134.937.4ʃ6.216.4ʃ1.8 N D:n o t d e t e c t e d.3结论本研究优化了从植物样品中提取和纯化激素,并利用超高效液相色谱-高分辨率质谱进行定性定量测定㊂10种激素在质谱上均有良好的响应,检测限为0.05~5n g/m L,定量限为0.1~10n g/m L㊂采用含1%甲酸的乙腈超声浸提小麦㊁水稻㊁烟草㊁棉花㊁番茄和拟南芥幼苗粉末,然后用固相萃取小柱进行样品前处理,最后用80%甲醇复溶,采用质谱全扫描模式测定各种植物激素的含量㊂本实验建立了简便快速提取和测定植物激素的分析方法㊂参考文献:[1] C O L E B R O O K E H,T H OMA SSG,P H I L L I P SAL.T h e J o u r n a l o fE x p e r i m e n t a l B i o l o g y,2014,217:67.[2] T A N KJG,P A N D Y A R V,T HA K E R VS.R S C A d v a n c e s,2014,4:12605.[3] WA N GL.D e t e r m i n a t i o no fP l a n tH o r m o n e s b y M a t r i xS o l i d-p h a s eD i s p e r s i o n-h i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a-p h y-T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y,H e f e i:U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y o f C h i n a(王璐.基于基质固相分散萃取-高效液相色谱-串联质谱的植物激素分析.合肥:中国科技大学),2014:3.[4] K U ICY,L I N Y Y,Z H O U X,e t a l.M i c r o c h e m i c a l J o u r n a l,2015,121:25.[5] 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y U P L C-T O F-M S.T e n p l a n t h o r m o n e s,i n c l u d i n g i s o p e n t e n e a d e n i n e, z e a t i n,r i b o s y l z e a t i n,s t r i g o l a c t o n e,m e t h y l j a s m o n a t e,a b s c i s i ca c i d,g i b b e r e l l i ca c i d,i n d o l e-3-a c e t i ca c i d, j a s m o n i c a c i da n ds a l i c y l i ca c i d,w e r es e l e c t e df o rd e t e r m i n a t i o ni nt h e m o d eo f M Ss c a n,M S/M Sa n d m u l t i-r e a c t i o nm o n i t o r i n g.A n dt h el i m i t so fd e t e c t i o na n d q u a n t i t a t i o n w e r ed e t e r m i n e d.S o l i d p h a s e e x t r a c t i o n(S P E)c o l u m n w a s u s e d t o c l e a n-u p h o r m o n e s f r o m p l a n t m a t r i x.T h e r e c o v e r y a n d r e p e a t a b i l i t y w e r e d e t e r m i n e d.D i f f e r e n t s o l v e n t s(i s o p r o p a n o l,a c e t o n e,m e t h a n o l,a c e t o n i t r i l e)w e r eu s e d t oe x t r a c t p l a n t s a m p l e s(r i c e,w h e a t,t o b a c c o,t o m a t o,e t c).T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e t e nh o r m o n e s h a d g o o d r e s p o n s e o nm a s s s p e c t r o m e t r y,a n d t h e l i n e a r c o e f f i c i e n t s b e t w e e nc o n c e n t r a t i o na n d r e s p o n s e v a l u ew e r ea b o v e0.99.T h er e c o v e r y r a t e so f200a n d50n g/m Lh o r m o n e sb y s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n c o l u m nw e r e o v e r90%,w h i l e t h er e c o v e r y r a t e so f10n g/m Lh o r m o n e sw e r ea b o u t80%.T h e r ew e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c y o f s e v e r a l d i f f e r e n t s o l v e n t s,a m o n g w h i c ha c e t o n i t r i l e a d d e dw i t h1%f o r m i c a c i dw a s t h e b e s t.H o r m o n e s c o u l db e r e c o v e r e dm o r e e f f i c i e n t l y b y d i s s o l u t i o n i n 80%m e t h a n o l.T h em e t h o d i s s i m p l e,r a p i dw i t h g o o d r e p r o d u c i b i l i t y,w h i c h i s s u i t a b l e f o r s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no f s e v e r a l e n d o g e n o u s h o r m o n e s i n p l a n t s a m p l e s.K e y w o r d s:H i g h r e s o l u t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y;P l a n t h o r m o n e s;Q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n。
一种适用于草本植物内源激素测定的高效提取方法[发明专利]
![一种适用于草本植物内源激素测定的高效提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ccb03a8958fafab068dc0290.png)
专利名称：一种适用于草本植物内源激素测定的高效提取方法专利类型：发明专利
发明人：蔡坤秀,牛先前,王龙平,陈振东,杨俊杰
申请号：CN201810196093.8
申请日：20180309
公开号：CN108414653A
公开日：
20180817
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于草本植物技术领域，公开了一种适用于草本植物内源激素测定的高效提取方法，称取叶底红0.2g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80％甲醇溶液10ml，放置4℃冰箱中过夜；加80％甲醇5mL洗涤残渣，重复操作2次，合并上清夜；过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次，合计大概6ml；‑80℃冷藏10min后冻干，得干粉；用A泵流动相溶解过Pak‑ODS‑C小柱；在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。
申请人：福建省热带作物科学研究所
地址：363001 福建省漳州市天宝五峰福建省热带作物科学研究所
国籍：CN
代理机构：重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙)
代理人：包晓静
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HPLC 测定内源激素
样品处理：各类试材均是在生长季的某一个或两个时期摘取1-5个新梢的中部叶片4-6片，做好标记存放于冰瓶中迅速带回实验室，在室内洗净灰尘杂物并吸干水分后，放入冷冻离心机冷冻干燥，研碎放入小塑料袋中置于-30℃冰箱中备用。
（1）激素的提取：
秤取0.1g由不少于4片叶子或其他部分构成，将称好的样品放入离心管中，用含有30ug/ml的二乙基二硫代氨基甲酸钠（抗氧化剂）的100%冷乙腈为浸提液，浸提三次，第一次加入10ml浸提液晃匀后将离心管密封置于0℃冰箱中静止浸提12小时左右，离心，上清液倒入小玻璃瓶，第二次加入5ml，在振荡器上以230转/分速度震荡提取2小时后离心，第三次加入3ml提取液清洗残渣，离心，都倒入小玻璃瓶中。
（2）第一次减压浓缩及溶解
将合并后的提取液倒入蒸馏瓶中，在37-40℃条件下减压浓缩至干，而后加入PH为8.0的0.4M的磷酸缓冲液2ml和2ml的三氯甲烷洗涤，倒入小玻璃瓶中。
用3ml 0.4M的磷酸缓冲液洗涤两次，再加入2ml三氯甲烷刷洗蒸馏瓶，倒入小玻璃瓶中。
（3）去除色素
首先将盛有溶解液的玻璃瓶封口在振荡器上振荡20min,而后用移液器抽取下层三氯甲烷，弃去，然后加入2ml三氯甲烷进行第二次去除色素。
如果水相中仍有色素则可重复上一步进行第二次色素去除。
(4)去除酚类杂质
对三氯甲烷萃取的水相溶液，倒入离心管，加入150mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（pvpp）,上下震荡，离心8000rpm,10min.
(5) 植物激素的萃取
移液器取上清液3ml, 滴加纯甲酸直至PH试纸为3.0，（经验值100ul左右），往此水相中加入乙酸乙酯振荡（3ml），移液器提取酯相（上层），其水相再用乙酸乙酯萃取两次（2ml, 2ml），合并所得酯相。
（6）第二次浓缩及进一步纯化
所得酯相倒入蒸馏瓶中，在37-40℃下减压蒸干，蒸干物用1ml色谱流动相溶解。
（7）溶解及过滤办法
由于最后溶解液1ml流动相即是HPLC上机样品，所以一定要在蒸馏瓶完全蒸干前提下一次性用移液管准确加入1ml,并充分溶解瓶内蒸干物质，尽量是瓶内溶液浓度均一，而后直接倒入干燥无水的滤膜过滤器的针筒中进行加压并使溶液通过直径为0.45um的水相微孔滤膜，压滤液存放于1.5ml离心管中用于上机测
定。
流动相配制：
甲醇：0.5%乙酸（55：45）
流速： 1ml/min
仪器准备：小玻璃瓶，10ml塑料离心管， 1.5ml离心管， 5ml玻璃注射器，过滤头，0.45um或0.22um的滤膜，1ml移液枪，枪头
磷酸盐缓冲液（0.4M phosphate buffer）
试剂：NaH2PO4.2H2O Na2HPQ4.12H2O
配制方法：
先配制0.4M的NaH2PO4和Na2HPQ4，两者按一定比例混合
（1）0.4M 的NaH2PO4：秤取NaH2PO4.2H2O 62.4g 或NaH2PO4.H2O 55.2g）加重蒸水至1000ml溶解
（2）0.4M 的Na2HPQ4：秤取Na2HPQ4.12 H2O 143.264g或Na2HPQ4.7 H2O 107.2g 或Na2HPQ4.2 H2O 71.2g, 加双蒸水至1000ml溶解
PH 0.4 M 的NaH2PO4(ml) 0.4M 的Na2HPQ4(ml)
7.0 39.0 61.0
7.1 33.0 67.0
7.2 28.0 72.0
7.3 23.0 77.0
7.4 19.0 81.0
7.5 16.0 84.0
7.6 13.0 87.0
7.7 10.5 89.5
7.8 8.5 91.5
7.9 7.0 93.0
8.0 5.3 94.7。