脐带血造血干细胞移植在临床上的应用研究_邵惠训 (1)

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.03.012 ·

综述· 脐带血造血干细胞移植在临床上的

应用研究

邵惠训

1988 年，法国 Gluckman 等采用脐带血移植治疗先天性再生障碍性贫血患儿以来，脐带血作为造血干细胞（HSCs）代用品治疗血液病备受人们关注[1]。脐带血造血干细胞（umbilical cord blood hematopoietic stem cells，UCB-HSCs）移植成功，带动和拓展了脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）和非常小类胚胎干细胞（very small embryonic-like stem cells，VSEL-SCs）移植的建立和应用。本文着重论述 UCB-HSCs、UC-MSCs 和 VSEL-SCs 移植在临床上的应用。

1 UCB-HSCs、UC-MSCs 和 VSEL-SCs 的来源与特性

胎儿是由生殖细胞精子和卵子结合形成的受精卵发育而成。受精卵发育分化成胚胎干细胞。细胞经过增殖和分化，形成各种组织器官，最后形成完整的人体。胚胎干细胞能诱导分化为人体各种细胞。HSCs 在体外能大量增殖，经筛选、冻存和复苏不会丧失其原有的活性。成体干细胞（adult stem cells，ASCs）存在于已经分化的组织中，能自我更新，形成各种组织细胞。脐带血是胎儿娩出，脐带结扎离断后残留在胎盘和脐带中的血液。

UCB-HSCs、UC-MSCs 和 VSEL-SCs 移植是一种无痛苦、无创伤的治疗方法。HSCs 移植后，除极少数患者有微热和头痛外，无严重不良反应。骨髓、外周血、脐带血和脐带都含有 HSCs，都具有较强增殖和多向分化能力。人体内本来就有一定数量的内源性干细胞，但都处于休眠状态。当脏器受到损伤时，内源性干细胞迁徙聚集到受伤部位，活化处于休眠状态的干细胞，分化为脏器功能细胞，修复受伤的组织和器官。然而，体内内源性干细胞数量极少，远远达不到使脏器修复、功能恢复的目的。因此，需要补充外源性干细胞，进行 HSCs 移植[2-3]。

人类脐带血和脐带中含有比成人骨髓更丰富的 HSCs 和造血刺激因子，具有集落形成能力强，自我更新和增殖潜力强，细胞毒性低的特点。HSCs 实际上就是 CD34+、CD38–细胞群。脐带血和脐带 CD34+、CD38–细胞的增殖分化能力高于骨髓，少量脐带血就能满足临床移植之需。与骨髓和外周血相比，UCB-HSCs 来源丰富，采集方法简便，采集脐带血对供者和胎儿无任何伤害；HLA 配型相合程度要求低，能耐受部分组织相容性抗原差异，脐带血移植物抗宿主病的发生概率很低；寻找 HLA 相合的脐带血所需时间较短；HSCs 移植后，感染病毒的风险很小；脐带血中的免疫细胞（T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）发育不成熟，细胞表面的抗原性很弱，患者自身的免疫系统对未分化细胞识别能力很低，从而避免了 HSCs 移植引发的免疫排斥反应和超敏感反应[4]。脐带血中还存在多种非造血干细胞和前体细胞。UCB-HSCs、UC-MSCs 和 VSEL-SCs 移植较非亲缘关系的骨髓移植更具优势，在临床上具有广阔的应用和发展前景[5]。

UC-MSCs 是一种成体干细胞，具备 T 细胞基本特性，来源于发育早期中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新和多向分化能力，存在于骨髓造血微循环内，支持骨髓 HSCs 生长。UC-MSCs 很稳定，无毒性，无致癌性，无免疫排斥作用[6]。在发育的不同阶段和特定环境，可分化为多种细胞。UC-MSCs 在脐带血中数量很少，可从脐带分离培养[7]。UC-MSCs 能分化为骨、软骨、神经、肝脏、骨骼肌、脂肪、内皮和纤维细胞，应用于组织损伤修复、基因治疗和 HSCs 共移植。

VSEL-SCs 存在于骨髓和脂肪组织中，是一类稀少的多能干细胞，具有胚胎干细胞的典型特征，有再生成各种人体细胞的潜能[8-9]。在组织器官受损时，VSEL-SCs 可从骨髓释放到血液循环，参与损伤脏器的修复。可用 G-CSF 将骨髓中的 VSEL-SCs 动员释放到外周血，通过血浆置换法收集。VSEL-SCs 可冰冻长期保存，以备将来医疗之需。VSEL-SCs 经体外培养，可分化成各种三胚层细胞系。

2 UCB-HSCs 的制备和移植程序

采集和保存脐带血和脐带的机构需要通过卫生部审批。在中心城市都应建立脐带血库。年龄在 18 ~ 35 周岁的健康孕妇，怀孕期间各种检测指标正常，无孕期并发症，都可作为采集脐带血和脐带的供体。孕妇入院时，必须携带脐带血库发给的脐带血采集用具。孕妇分娩前提醒助产医生协助抽取母血，采集脐带血和脐带，并通知当地脐带血库。脐带血库应安排具有恒温设备的收采脐带血和脐带的车辆，在18 h 内前往孕妇待产医院收取脐带血和脐带，以确保脐带血和脐带细胞活性。脐带血库在 60 个工作日内确认脐带血和脐带是否符合入库储存标准。脐带血和脐带在理论上可长期保存。

开展 UCB-HSCs 移植的医院，应具有质量控制和质量评价措施的临床实验室和有细胞计数和 HLA 组织配型的

作者单位：100012 北京实验动物研究中心，Email：huixunshao@ 收稿日期：2013-01-27

检测能力。HLA 在血清学上分为 HLA-A、B、C 和HLA-DR、DQ。同基因孪生兄弟姐妹 HLA相合率为 100%，异基因孪生或亲兄弟姐妹为 1/4，人类非血缘关系的 HLA 相合率为1/400 ~ 1/10000。

用流式细胞仪从产妇脐带血分选出 CD34+ 和 CD38– 标记的脐带血原始细胞，在添加 IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、IGF-1 和 SCF 混合因子的干细胞培养基内进行增殖。

UCB-HSCs 一般采用静脉输入给受者。股骨内注射能快速产生高水平的髓系和红系细胞，值得关注。用双份脐带血移植可克服单份脐带血细胞数量不足之虞。

3 UC-MSCs 的制备和移植程序

在 GMP 实验室内，将新鲜采集的脐带剪成 1 ~ 2 mm3的组织块，先后用 0.075% II 型胶原酶和0.125% 胰酶消化。消化产物经 100 μm 滤器过滤，获得细胞悬液。离心后重悬于 5% 胎牛血清的 LG-DMEM 培养基，接种培养瓶内，置 CO2孵箱 37 ℃培养。细胞达 80% 融合时，用0.25% 胰酶消化传代。

移植用 UC-MSCs 为第 2 ~ 4 代细胞，经静脉输注给受者。输入的细胞数应为 1 × 106/kg 体重。

4 HSCs 移植的临床应用

4.1 抗衰老

通过体外 HSCs 移植，抑制衰老。输入干细胞或活化体内处于休眠状态的干细胞，系统提高全身细胞更新能力和活性，改善组织和器官功能。HSCs 移植抗衰老最适合于中年人。在这一时期，人的衰老是可逆的。

HSCs 移植用于隆胸、丰唇、隆下巴和皮肤除皱。干细胞植入人体后，经血流迁徙到表皮，释放出生长因子和细胞因子，促进胶原蛋白生长，使皮肤恢复弹性、白皙、富有光泽。保护真皮层成纤维细胞免受氧化游离和紫外线侵袭。HSCs 移植使皮下组织充盈，皮肤红润，皱纹和色素沉着减少。人的心情也变得舒畅、愉悦。干细胞美容尚处于研究实验阶段，技术尚不成熟，事故常有发生。卫生部食品药品监督管理局尚未批准干细胞产品用于美容。

4.2 抗肿瘤

在人体免疫系统，有两种专门抗击肿瘤的细胞，一种是树突状细胞（dendritic cells，DCs），能激活人体免疫应答，主动搜索和识别肿瘤细胞，抑制肿瘤形成和扩散；另一种是细胞因子活化杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）。DCs 由 CD34+和 CD14+细胞产生，存在于骨髓、脐带血、脐带组织和外周血中，是人体内功能强大的抗原提呈细胞，能诱导出抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），在肿瘤免疫治疗中发挥着极其重要作用。CIK 细胞同时表达 CD3+、CD56+两种细胞膜蛋白分子，又称为 NK 细胞样 T 细胞，能主动识别和定向精确杀灭肿瘤细胞，防止肿瘤的扩散和转移。而不损伤正常组织和细胞，对人体无毒副反应。CIK 细胞是人体外周血或脐带血在体外用多种细胞因子诱导而获得的一群异质细胞，是一种新型、高效、广谱杀伤肿瘤的免疫效应细胞。脐带血 CIK 细胞体外扩增快，杀伤肿瘤细胞活性强，对肿瘤细胞的作用优于外周血 CIK 细胞。

DCs 与 CIK 共育，能相互调节，增加细胞因子释放，使 CIK 细胞溶瘤活性显著增强，对靶细胞的杀伤作用更加具有特异性，能大幅度提升人体免疫力。CIK 细胞扩增效率高，抗击细胞凋亡、杀灭肿瘤活性明显高于 LAK 细胞。肿瘤患者经干细胞移植治疗后，由于体内尚有少量肿瘤细胞残留，常引起肿瘤复发。DCs-CIK 细胞移植能防止微小残留病作祟，杀灭残留在血液和淋巴液内的肿瘤细胞。这就是 Steinman 与美国斯坦福大学创建的“CLS（care life of science）细胞免疫治疗技术”。CLS 技术从根本上治疗和控制肿瘤生长，防止肿瘤复发。Steinman 因此获得了 2011 年诺贝尔生理学或医学奖。在健康人体，DCs 和 CIK 细胞数量极少，在肿瘤患者体内数量更少。在脐带血和脐带中，能分离到这两种细胞，经培养和活化，再回输到患者体内，有效清除血液和淋巴液中残存的肿瘤细胞，抑制肿瘤复发和转移。适用于不同病期的肿瘤患者治疗。DCs-CIK 细胞移植与手术治疗、放疗和化疗联合使用，效果更加显著。CLS 技术在美国的临床实验表明，提高了肿瘤患者 5 年生存率近一倍，这标志着肿瘤患者的命运已被改写，对于改善患者生活质量具有重大意义[10-13]。

HSCs 移植在治疗多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、白血病、肺癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌和其他恶性肿瘤方面取得了良好效果[14]。2010 年 4 月 29 日，美国 FDA 批淮了DCs 疫苗治疗前列腺癌。DCs-CIK 细胞共育，能提高 CIK 细胞对 SMMG-7721 肝癌细胞的杀伤力，其杀灭肿瘤作用比单纯 CIK 细胞更强。应用肾癌细胞裂解物的 DCs 细胞疫苗联合 CIK 细胞治疗晚期肾癌患者，能诱导特异的抗肾癌免疫反应。

艾辉胜团队建立的微移植疗法治疗急性髓性白血病取得了重大进展。患者接受微量化疗后，输入造血干细胞，能激发患者自身免疫系统，还能清除患者体内残存的癌细胞，降低了感染和罹患肺炎并发症的风险。微移植疗法不受患者年龄和配型限制，为白血病和肿瘤患者提供了安全高效的新治疗手段[15-16]。

4.3 治疗自身免疫性疾病

机体对自身抗原缺乏免疫耐受而发生免疫反应，导致自身组织损害，形成自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）。AID 患者病程迁延，致残率高，生活质量差，且无理想的治疗方法。患者体重降低、脾脏肿大、自身抗体形成、Th1 和 Th17 细胞增加，引发炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）。IBD 患者体内正常组织遭受免疫系统攻击，发生病变。局部皮肤溃烂，消化道出血。DCs 能引发 T 细胞免疫耐受功能，逆转自身免疫反应[17]。重建新的造血系统，皮肤溃烂的疮口逐步愈合，消化道出血停止，症状得到改善。