L-赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化

ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＳＭ）
万方数据
２００９年１９（４）
生物技术
３７
Ｌ一赖氨酸又名ａ，￡一二氨基己酸或２，６一二氨基己酸，分
子式为ＱＨ。。Ｎ２Ｑ，结构式为ＮＩ－１２一（ＣＨ２）。一ＣＨ（ｍ）一
ＣＯＯＨ，分子量为１４６。赖氨酸是柱状晶体，溶于水，熔点为２２４ —２２５。Ｃ，有右旋光性。
［１３］夏凡，琚争艳．微生物碱性蛋白酶在食品工业２．
Ｌ一赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化
陈银芳，张伟国。
（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２）
摘要：目的：获得Ｌ一赖氨酸高产菌及得到最优的发酵培养基。方法：以黄色短杆菌（Ｂｒｅｂｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＸＱ一８为出发菌
ＭｇＳ０４·７Ｈ：０ ０．１、ＭｎＳ０４·４Ｈ，Ｏ ０．０１、ＦｅＳ０４‘７Ｈ２０ ０．０１、ＶＨ
３０ｔ，．ｇ、ＶＢ，１００／．Ｌｇ、Ｌ—ｍ０．４、尿素１．５，琼脂２０。
（２）完全培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖５、牛肉膏１０、蛋白胨１０、ＮａＣｌ ５、琼脂２０。
（３）种子培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖２５、玉米浆２５—３０、（Ｎ心）２Ｓ０４ ５、ＫＨ２Ｐ０４ １、Ｍｇｓｏ，，·
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０．６６％、１．５％时赖氨酸达到９４９／Ｌ，比优化前提高２２．１％。结论：筛选的（ＳＧＷａｌ一）标记是有利于Ｌ一赖氨酸的积累，添加乙酸和
吐温一８０对提高Ｌ一赖氨酸的产量是有效的。
关键词：Ｌ一赖氨酸；育种；黄色短杆菌；响应面分析法
中图分类号：ＴＱ９２２．３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００４—３１１Ｘ（２００９）０４—００３６—０５
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｕｎｄｅｒ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＣＨＥＮ Ｙｉｎ—ｆ赫ｇ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ—ｇｕｏ’
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎ目ａａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
ｕｎｄｅｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｗｅｅｎ一８０ ａｎｄ ＣＯＩＴＩ ｓｔｅｅｐ
ｈｉｌｕｍ．Ｃ伽ｄＩ咖：Ｓｃｒｅｅｎ． ｌｉｑｕｏｒ．Ａｓ ａ ｒｅｓｅｔ，ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉａ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｔｗｅｅｎ一８０ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｗｅ淝０．３２％，０．６６％，
至７．０—７．２．１２１℃灭菌２０ｒａｉｎ。
发酵培养基用２０％ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０～７．２，１１５℃灭菌
８ｍｌｎ。
１．２方法 １．２．１培养方法 １．２．１．１斜面、平板培养方法
恒温箱温度３０±１℃，培养２４ｈ。 １．２．１．２摇瓶培养方
摇床为往复摇床，振次１００±２次／ｒａｉｎ，温度３０±１℃，种子 装液量２５０ｍＬ三角瓶３０ｍＬ，种子培养１２ｈ；发酵装液量５００ｍＬ
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ｍｅｄｉｕｍ，ｔｗｅｃｎ一８０ ｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ），ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｅｆｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｎｄ ＤＭＳＯ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏ．
ｃｅｓ￥．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａ ｎｅｗ Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ—ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｘ０—８９（ＳＧ’Ｖａｌ一）ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＷａＳ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ７７∥Ｌ
作者实验保藏菌株黄色短杆菌（Ｂｒｅｂｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ加帆）ＸＱ
一８。
１．１．２试剂 Ｌ一赖氨酸、Ｌ一缬氨酸等为上海生化技术公司产品；ＮＴＧ、
ｓＧ均为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；ＤＥＳ为国药集团化学试剂有限 公司产品；茚三酮为上海试剂三厂产品。 １．１．３培养基
（１）基本培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖２０、（Ｎ地）２Ｓ０４ １．５、Ｋ２ＨＰ０４·３Ｈ２０ ３、ＫＨ２Ｐ０４ ｌ、
嘲ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ０ｆ Ｔｈｅｎｍｓｔａｂｈ Ｓｅｒｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏ．
ＰＥ一１１［Ｊ］．ＡＡ髂跏Ｓｄ ｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ａ Ｎｅｗｌｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｂａ９２／ｕｓ ｓｕｂｌｉｔｉｓ
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株，经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、亚硝基胍（ＮｒＩ．｜Ｇ）逐级诱变处理，在发酵培养基中添加乙酸和乙醇，在发酵过程中添加吐温一８０和二甲基
亚砜。结果：获得一株Ｌ一赖氨酸高产菌ｘＱ一８９（ｓＧｒｖａｌ’），摇瓶发酵７２ｈ赖氨酸产量达到７７９，Ｌ，对乙酸、吐温一踟和玉米浆三
因素利用响应面分析法（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）对其添加量进行优化。当乙酸、吐温一８０及玉米浆的添加量分别为０．３２％、
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｇｅｔ Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ—ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ—ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｒｅｂｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｌａｖ啪ＸＱ一８９，ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＥＳ）ａｎｄ Ｎ—ｍｅｔｈｙｌ—Ｎ’一ｎｉｆｒｏ—Ｎ—ｎｉｔｒｏｓｏｇ．
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［１２］Ｋｕｒｍｍｎｅｎｉ Ａｄｉｎａｒａｙａｎａ，Ｐｏｈｒｉ Ｅｌｌｌａｉａｈ，Ｄａｖｕｈｒｉ Ｓｉｖａ Ｐｒａｓａｄ，ｅｔ ａ１．
天然屏障，对动物的营养、生长、健康、防病、免疫等方面起着 重要作用。从鱼消化道分离的菌体通过适当的途径再作用于 鱼类，不仅有利于菌体在宿主体内定植撙Ｊ，建立鱼肠道的正常 菌群，而且在鱼体内发酵和代谢过程中，产生促生长素之类的 物质和各种酶类，提高动物的消化酶活性，促进鱼类的生长和 成活¨０】。我们从丁鳜肠道中筛选出产蛋白酶的枯草芽孢杆 菌，该菌蛋白酶的最适ｐＨ为９．８，是一种能耐受强碱的碱性蛋 白酶。碱性蛋白酶的最适ｐＨ范围与微生物种属之间并无明 显的关系，最适ｐＨ在８．０。１１．５之间。该菌蛋白酶的最适温 度为４０℃，在５０℃作用３０ｍｉｎ，该酶仍然能保持较高活性。碱 性蛋白酶的最适作用温度一般在３０～７５℃之间，但是主要为 嗜中温蛋白酶ｕ“。Ｋｕｎａｍｎｅｎｉ Ａｄｉｎａｒａｙａｎａ［１２０等人研究了枯草 芽孢杆菌ＰＥ一１１蛋白酶的热稳定性表明，该酶在６０℃处理了 ３５０ｍｉｎ酶仍保持１００％活力。不同菌株产生的碱性蛋白酶，金 属离子对其的影响不同。大多数碱性蛋白酶发挥作用时不需 要特定的激活剂，但是需要金属离子激活，必需的金属离子有
７Ｈ，Ｏ ０．５、ＣａＣ０３ １０。
（４）发酵培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖１５０、玉米浆１５、（Ｎ凰）２Ｓ０４ ５０、ＫＨ：，Ｐ０４ １、ＭｇＳ０４·
７Ｈ２０ ０．５、Ｌ—Ｔｈｒ ０．４、ＭｎＳ０４·４Ｈ，Ｏ ０．０１、ＦｅＳＯ．，。７Ｈ２０ ０．０１、ＶＨ
１００ｐｇ／Ｌ、ＶＢｌ ２００ｐ．ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ，４０。 基本、完全和种子培养基均用质量分数２０％ＮａＯＨ调ｐＨ
Ｌ一赖氨酸是人体和动物所不能合成的８种必需氨基酸 中最重要的一种。赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产 品ｎ’２】，消费需求每年以７～１０％的速度递增，国内则以每年 ３０％以上的速度递增。研究赖氨酸的生产对我国有重大而深 远的影响，对提高国际竞争力具有十分重要的意义。国际上 利用基因工程技术，通过在Ｅ．ｃｏｌｉ中增加ⅡＩＩｆ基因的表达来提 高赖氨酸的产量【３’；以Ｃｏｒｙｎｅｂａａｅｒｉｕｍ ｇｆｌ‘细ｍ妇棚ＡＴＣＣ ２１２５３ 为生产菌，使肌醇六磷酸为惟一碳源来发酵生产赖氨酸［４ Ｊ，但 是对赖氨酸的产量并没有显著的提高。本文根据赖氨酸的代 谢途径分析，筛选磺胺胍抗性突变株能解除天冬氨酸对磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶的反馈抑制，缬氨酸缺陷型能增加赖氨酸 合成的前体晤】，基于添加乙酸、吐温一８０、玉米浆对赖氨酸产 量有很大的影响，本文对乙酸、吐温一８０和玉米浆三因素利用 响应面分析法对其添加量进行优化，进一步提高了赖氨酸的 产酸率。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１菌种
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生物技术
２００９年１９（４）
ｎｄ＋、ＭＳ＋、ｚｎ２＋、ｃ０２＋、Ｆｅ２＋等ｍ１，我们分离得到的枯草芽孢 杆菌蛋白酶活性受ｃｄ＋、ｃ０２＋的强烈抑制，Ｐｂ２＋和ＥＤＴＡ对酶 活性也有较强的抑制作用。Ｆ分＋和Ｍ孑＋对酶活力影响较小， 该酶活性不依赖金属离子。
图６金属离子及ＥＤＴＡ对酶活力的影响 Ｈｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｒｏｎ ａｎｄ ＥＤＴＡ ０１１ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 活性，对肠道内营养物质的消化吸收，饲料的利用率有直接的 影响。王福强等（２０Ｑ５）将枯草芽孢杆菌饲料投喂牙鲆幼鱼，结 果表明牙鲆幼鱼消化道酶活性增加、体质量增加川。华雪铭 等在异育银卿饲料中添加０．２％的芽孢杆菌组，增重率比对照 组提高了３３％Ｉｓ］。正常肠道微生物菌群在机体内可构成一道
１．５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｌ—Ｌｙｓｉｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ９４９，Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｏｖｅｒ ２２．１％ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｇ（ＳＧｒＶａｌ一）ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｉｖｅｄ ｔｏ ｔｈｅ