锌指蛋白在各个组织中表达量的测定

印记基因的鉴定及功能分析

----锌指蛋白在各个组织中表达量的测定

生物技术孙业润（1092810108）

实验目的：

走进实验室了解基本实验仪器，练习对各种仪器的使用;

学习PCR原理，掌握PCR操作;

通过电泳对DNA进行分析;

探究锌指蛋白在不同组织中的表达量对比。

实验原理：

1，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2，NDA凝胶电泳：NDA凝胶电泳是常用的用于分离鉴定DNA,RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂糖作为支持物，利用DBA分子在涌动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电势点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的移动速度与其相对分子质量成反比，当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色，在紫外灯光下可以检测出DNA条带，从而确定DNA片段在凝胶中的位置。与通过marker比较可进行更加深入的研究

3，通过比较不同组织cDNA中锌指蛋白基因PCR后DNA带的亮度来确定表达量的多少，但是DNA多也可能是因为模板中可能存在重复的编码序列

即基因的初始浓度高，所以要通过内参基因（在不同组织中表达稳定的基因）来确定待测基因的初始浓度。

4,锌指基序（zinc finger motif）。许多转录因子中都含有锌指基序。这些蛋白通常含有多个指状结构可以插入靶DNA序列的大沟中。许多锌指蛋白的比较表明，基序为多种氨基酸序列提供了各种识别DNA序列结构的框架。

实验材料及仪器：

DNA凝胶电泳：

材料：琼脂糖，电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），

仪器：微波炉，电泳槽

PCR: 材料：dNTP，脑舌心肝肺胎盘的cDNA锌指蛋白引物，内参基因引物，酶，水，镁离子

仪器：PCR仪，PCR管

其他仪器：微量移液器，简要离心机，漩涡混合仪等

一些实验仪器的使用方法:

1 微量移液器，可以准确吸取少量的液体。

一个完整的移液过程包括：

1)容量设定

2)安装移液头

3)吸液

先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸液头垂直浸入液面。尽量避免吸液头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。同时可以避免在吸取粘稠液体时在吸液头表面粘上液体影响吸取精度。

松开移液器排放按钮要平稳，切记不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。

4)排液

排液时，吸液头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸液头内无残留液体。

5)卸去移液头

一般用力下按吸液头推出器即可卸掉吸液头。

6)如不使用，将移液器调到最大量程。

2 简要离心机，经过简要离心，粘在容器壁上的液体会被离心到底部，方便吸取

3 漩涡混合仪，混合，混匀液体。

微量移液器（也称枪）漩涡混合仪

实验步骤：

1配置10mlPCR体系

按如下反应体系逐步加入各反应试剂：

Components V olume Final Concentration ddH2O to final volume 10 μl Not applicable

10×EasyTaq Buffer ( 含Mg2+) 1 μl 1×

25 mM dNTPs 0.8 μl 0.2 mM

Forward +Reverse Primer (5 μM each) 1 μl 0.2 each EasyTaq DNA Polymerase 0.05 μl 2.5 units

1*cDNA Template 1 μl as required

2使用PCR仪进行扩增按以下程序设定PCR反应程序：

94℃ 2-5 min

94℃ 30 sec

50-60℃ 30 sec 25 - 35 cycles

72℃ 1min/1-2 kb

72℃ 5-10 min

16℃∞

3配置琼脂糖凝胶

1）用自来水或蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，将制胶板放入胶槽中；

2）根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；

3）放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴溴化乙锭（EB）荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入胶槽中，小心去除其中气泡，然后插上梳子待其凝固；

4）室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5）向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。

4对DNA进行电泳

在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；

根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

5荧光下观察拍照

Loading buffer 是蓝色的，在凝胶上出现的蓝色的带是Loading buffer的位置而不是DNA的位置，对DNA的观察需要在紫外灯下，配置凝胶时所加入的溴化乙锭EB含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。

实验结果：