木聚糖酶在大肠杆菌中的表达

嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B 克隆及其在大肠杆菌中的表达

食品科学093

谢江英

2009016513 自 Horflcoshi 于 1973 年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研工作者已分离出百余种不同微生物来源的木聚糖酶，并将其基因在各种宿主菌中得到活性表达。由于高产野生的微生物生产木聚糖酶时，释放出的产物较为复杂，往往产生大量的纤维素酶，导致在应用中产生不必要的麻烦。如在纸浆预漂白时，纤维素会被意外降解。并且这些酶的性质极为相近，分离纯化的成本较高，不利于木聚糖酶的推广使用，通过基因工程的方法来构建一些高效表达或胞外分泌的工程菌株，将有助于解决木聚糖酶的大量收集和纯化问题。我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，大多限于天然木聚糖酶高产菌株的筛选，木聚糖酶的分离、纯化及性质分析，仅克隆和表达了少数木聚糖酶基因，而运用基因工程手段产业化生产木聚糖酶制剂在国内还刚刚起步。本研究从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 分离出木聚糖酶基因 xyn10B，连接于表达载体 pET-28a（+）的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codon plus-RIL，构建基因工程菌，实现木聚糖酶高效表达。

1 实验材料

1.1 菌株和质粒

（1）热解纤维素菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725；

（2）质粒 pET-28a；

（3）大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codonplus-RIL；

1.2 实验材料及主要试剂

1.2.1抗生素

氨苄青霉素，卡那霉素

1.2.2 试剂

胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖；PCR引物合成；DNA测序；不同来源底物；

其他常用化学试剂。

1.2.3 工具酶

限制性内切酶Nco I、Xho I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000 DNA Marker 和λ-HindⅢ digest DNA Marker）。

1.2.4 试剂盒

PCR产物回收试剂盒，质粒小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，

Ni-柱纯化柱料。

2.培养基及主要试剂配制

（1）TAE buffer：核酸电泳缓冲液

Tris-乙酸 0.04 mol/L

EDTA 0.001 mol/L

（2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

Tris碱 15.1 g

甘氨酸 94 g

SDS 5 g

去离子水补齐至1000ml。

（3）考马斯亮蓝染色液配方

甲醇/水（1 :1，v/v） 90 ml

冰醋酸 10 ml

考马斯亮蓝R250 0.25 g

应用What man1号滤纸过滤，除去杂质，室温；备用。

（4）考马斯亮蓝脱色液

乙醇 100mL

乙酸 50mL

蒸馏水定容至1L。

（5）8×bindingbuffer（连接缓冲液）

NaCl 4 M

Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM

（6）8×charge buffer

NiSO4 800 mM

（7）8×washbuffer（洗涤缓冲液）

咪唑 800 mM

NaCl 4 M

Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM

（8）4×strip buffer

EDTA 400 mM

NaCl 2 M

Tris-HCl（pH 7.9） 80 mM

（9）蛋白质 SDS-PAGE 凝胶的配制

溶液成分分离胶 12%（5mL）浓缩胶 5%（2mL）

H2O 1.6 1.4

30%丙烯酰胺溶液 2.0 0.33

1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 1.3 ---

1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） --- 0.25

10%SDS 0.05 0.02

10%过硫酸铵 0.05 0.02

TEMED 0.005 0.002

（10）宽范围缓冲液

乙酸 100mM

N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPS） 100mM

N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS） 100mM

3-环已胺基丙磺酸（CAPS） 100mM

2-码啉乙磺酸（MES） 100mM

分别在60℃，70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液，使用1M NaOH调节

至所需的pH值。

3.实验仪器

振荡培养箱、无菌操作台、0.22μm无菌滤器、冷冻高速离心机、2550 紫外分光光度计、Gene pulser Xcell、实验室水纯化系统、超滤管 Ultrafreet-MC 10kDa、垂直电泳仪、无油真空抽滤仪、AKTA prime plus 蛋白层析仪、聚合酶链式反应器

⑴.Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 的液体培养

按照 DSMZ 的配方，配置厌氧培养基，分装于厌氧试管中，每管 5ml，培养基封闭后用

真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体（80%N2和20%CO2）。在厌氧箱中用培养基1m溶解购买于 DSMZ的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，按照 1%的接菌量接种于5ml 试管中，混匀，75℃静置培养数天，直至细菌开始生长

起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中 75℃培养数天，-80℃保存菌体备用。

⑵.基因组 DNA 的提取

取5ml小试管培养的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组 DNA 小

量提取试剂盒提取细菌的基因组，所得染色体 DNA 溶液放 4℃冰箱备用。

⑶. Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的序列分析

⑶.Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的克隆

以嗜热细菌 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B的基因组 DNA为模板，通过上游引物和下游引物进行嗜热木聚糖酶基因（xyn10B）的扩增。

上游引物：5’CCAGTC CCATGG AGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为NcoⅠ酶切位点；

下游引物：5’CGACGA CTCGAG AAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为XhoⅠ酶切位点；

xyn10B 基因全长 1014bp，在 50 ul PCR 反应体系中，以基因组 DNA 第一链为模板，在无菌微量离心管中依次加入下述试剂（表 2-1）。

轻轻混匀后迅速离心，95℃预变性3 min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃，延伸 90s，进行32个循环，然后72℃延伸 20min，4℃保存。PCR 完成后，取 2u1扩增产物进行琼脂

糖凝胶电泳，ChampGel 1000 型凝胶成像系统中进行图像采集与分析。

通过 PCR 发现在退火温度梯度 50-60℃内都有产物，其中55℃产物的浓度及纯度最好（图 2-3），电泳结果表明 PCR 产物与理论长度相符。PCR 产物使用 PCR 清洁试剂盒回收，双酶切后电泳鉴定并估计浓度，-20℃保存，备用。

⑷.载体制备及重组质粒的构建

使用NcoⅠ和XhoⅠ酶切质粒载体pET-28a，去磷酸化后使用 PCR 产物纯化试剂盒回收，电泳鉴定并估计浓度，-20℃保存，备用。