图位克隆原理

孟德尔规律
• 二、非等位基因间的相互作用 无互作： 9:3:3:1 有互作： 9：7 互补作用 15：1 重叠作用 13：3 抑制作用 9：6：1 累加作用 9：3：4 隐性上位作用 12：3：1 显性上位作用
Thanks for attention.
• END
F1 plant
假设： 只存在单交换
自交
F2 plants
只有左侧三种植株会选入定位群体
分子标记M5与突变位点的遗传距离：
M5处发生交换的植 株包括三种情况
10/100
6/100
4/100
(20/(100×2 )) ×100%=10cM
假设： 统计100个个体
分子标记M4与突变位点的遗传距离：
在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是 • Landsberg erecta(Ler) • Columbia(Col) • Wassilewskija(Ws) • 其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。
SSLPs
Marker
CAPs dCAPs
InDel SNP
• SSLP
= simple sequence length polymorphisms 简单序列长度多态性 又称 SSR= simple sequence repeats 比较产物长度
• 点击目标区域
• STEP2: 把目标区域内的BAC名字记录下来 • 例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有 • K14A17→MCE21 →MGD8 →MTO12 →MKP6 →MIG5 →MEB5 →MBG14 →MRC8
• STEP3: 把目标区域内的BAC名字分次键入 到AMP的Marker搜索栏
6号个体 1 0 1
12号个体
1
0
0
表格的跑样结果显示Marker2最接近突 变位点，Marker3次之，下一步可以 在Marker2和Marker3附近寻找新标 记引物
重组子筛选
1. 建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2. 可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3. 要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物
统计计算Rf
什么是重组子
• 在突变位点附近区域内绝大部分 的样品跑样结果都应该为只有非 重组的Col条带，即记录Rf为0， 只有少数的样品存在交换，Rf记 为1。 • 图中的6、12号样品即为重组子
筛选重组子的目的
• 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设 在目标区域内寻找到新的标记引物，就 不需要把所有的个体跑样，只需要跑重 组子个体 • 例： Rf Marker1 Marker2 Marker3
显性突变 突变基因： A（短根） 正常基因： a （长根）
• 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因 此下面提到的突变的基因都应该会导致幼 苗短根。 杂交F1代 突变体 x Ler 隐性突变 单 aa（短根） AA（长根） 基 Aa（长根） 因 突 杂交F1代 变 突变体 x Ler 显性突变 AA（短根） aa（长根）
交换次数
配子总数 3×2 + 7
×100%
=
19 × 2
×100% ≈34 cM
SSLPs
SSLPs
• 40.48% • 4.76%
4.76%
12.5% 12.5% 36%
• 20.00%
步骤总结
筛选 F2 代 短根 移栽
3周左右
提基因组
各对引物PCR
缩小范围 寻找新Marker 扩大群体 (筛选重组子)
• 注意: • 每个株系到精确定位后期可能用到数十上 百的MARKER，请将自己使用、订制过的 MARKER的相关资料清晰记录下来，便于 日后查看。
目标区域内基因搜索
附加
• 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因 此下面提到的突变的基因都应该会导致幼 苗短根。
单 基 因 突 变 隐性突变 突变基因： a（短根） 正常基因： A （长根）
Aa（短根）
隐性突变
杂交F2代 Aa（长根）
单 基 因 突 变
AA Aa（长根）： aa（短根） 3 ：1 杂交F2代 Aa（短根） 显性突变
AA Aa（短根）： aa（长根）
3 ：1
• 注意事项：一般出现的突变大多数为隐性 • 注意事项2：由于根长还会受环境因素影响， 突变，因此理论上F1代都为长根(Aa) ; 如 杂交F1代 有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对 果不是，造成短根表型可能是2种情况： 突变体 x Ler 隐性突变 照也长得不好的情况。 • （1）突变为隐性突变，杂交不成功，种子 单 aa（短根） AA（长根） • 建议处理方法：分类后全部移栽，分成长根、 基 为母本突变体自交所得（aa），表现为F1 中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（ 2 Aa（长根） 因 代长短分离； 至3周后）编号后单株提取基因组，用任意一 突 • （2）突变为显性突变，杂交F1代为Aa 突变体 x ，验证杂交苗 Ler 对粗定位用的 SSLP 引物做 PCR 变 （短根），杂交不成功的母本自交种为AA 真假。 AA（短根） aa（长根） 显性突变 （短根），表现为F1代全部为短根 • 真的F1杂交苗为双带，假的为单带（col带） Aa（短根）
SSLPs
父本染色体
F1
母本染色体
假设： Aa 突变位点 Bb Marker 突变为 隐性突变
F1
F1 配子
长根
长根
长根
长根
长根
短根
长根
长根
短根
短根
F2 短根个体
Col 单带
Ler单带
Col Ler 双带
• 因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选 择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突 变位点不可能存在交换，交换率= 0 • 其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交 换次数
注意后两种情 况反映的是来 自于两个配子 的染色体区段 的情况
包含来自于 两个亲本的 染色体片段
包含来自于 Col 两 条 染 色体区段
பைடு நூலகம்
包含来自于 Ler两条染色 体区段
*
Col
*
* **
*
*
**
1、4、8、10、11、13、15、18、19共9个 样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段， 没有发生交换
6/100
4/100
(10/(100×2 )) ×100%=5cM
分子标记M3与突变位点的遗传距离：
4/100
(4/(100×2 )) ×100%=2cM
如何分辨来自于两个亲本的染色体？
M4 m4
目前最常用的分子标记 是利用两个亲本中同一 染色体区段的长度差异 来设计的，如左图亲本 Ler的M4处染色体区段长 于亲本Col中m4染色体区 段，在该差异位点两侧 设计引物经PCR扩增后得 到的PCR产物就会有不同 长度，电泳后 M4 泳动速 度慢， m4 泳动速度快， 因此通过电泳就可以分 辨来自于两个亲本的染 色体区段
Ler
Col
wild type
mutant
假设： Aa 突变位点 有5个Marker
杂交
图中的两个亲本不但在 A/a位点有差异，在其他 位点也存在大量的遗传 差异，可以利用这些差 异设计分子标记，对染 色体的具体区段进行标 定。在该例子中，该染 色体上总共确定了 5个分 子标记，标定了5个不同 区段。
SNP = single nucleotide polymorphism • 单核苷酸多态性 • 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异 所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性 只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个 碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入 或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种 情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel） • 密度： 每 3.3kb 存在一个
引物寻找
• • • • 1.山大丁老师 提供的引物 2.TAIR网上提供的常用Marker 3.AMP上提供的常用Marker 4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料
STEP1: 把目标区域内的Marker序列贴进TAIR 网上的Seqviewer上搜索目标区域
MPK6 FP:
AATCTTGTAATCTGGTGCGTG
**
Ler
*
5、6、14共3个样品，只包含来自于亲本Ler的 染色体区段，也就是发生了两次交换
**
Col Ler
*
*
*
**
2、3、7、9、12、16、17共7个样品，包含1个 来自于亲本Col的染色体区段以及1条来自于亲 本Ler的染色体区段，即发生了一次交换
• 突变位点与分子标记M的遗传距离：
杂交F2代 •• 注意事项 2 ： 隐性突变 注意事项：一般出现的突变大多数为隐性 Aa（长根） 突变，因此理论上F2代都为短根(aa) 应为 • 某些株系如果刚好是双突变，则分离比会根 播种数的1/4。但实验上，分离是随机的， 据不同情况而偏离 3：1，例如15：1等情况 实际情况未必是 3： 1，但总体上也应该是 AA Aa （长根）： aa（短根） • 如果在 F1 代中混有非杂交苗，即混有突变体 单 长根占大多数，短根占少数。 3 ：1 苗，则可能造成收集到 F2代种子中混有突变 • 某些株系，萌发率特别低，因此 aa的种子 基 杂交1/4 F2代 体自交种（ aa), 使短根大于 ，但由于这 未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体 因 低于1/4。因此，统计 F2 表型时，要统计播 Aa （短根） 各情况造成的偏离程度无法估计，短根大于 突 种总数、萌发数、长根、短根等项目，以 1/4 也有可能只是随机分离造成的，两者无 变 显性突变 便分析。 法分辨，因为F1的筛选和收种十分重要，要 AA Aa（短根）： aa（长根） 谨防种子污染。 3 ：1
• CAPs
= cleaved amplified polymorphic sequences 酶切扩增多态性 利用酶切位点
Marker: MIG5-B
H C C
L
• dCAPs = derived CAPS 设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点
其它标记
InDel
= insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两 种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲 本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量 的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失 位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是InDel标记。 部分SSLP就是由 InDel转化而来 • 密度： 每 6.6kb 存在一个
补充
孟德尔规律
• 一、显隐性关系的相对性 (1)完全显性：F1表现与亲本之一完全一样， 而非双亲的中间型或同时表现双亲的性状； (2)不完全显性：F1表现为双亲性状的中间型。 (3)共显性：F1同时表现双亲性状，而不是表 现单一的中间型。 RR ↓ rr •由于根长还受影响培 Rr 养环境等影响，因为 ↓ 不完全显性的情况比 1RR : 2Rr : 1rr 较难判断