实验一、RNA提取方法及原理

二、方法及原理
1 、 RNA的提取流程
（1）样本前处理 （2）细胞裂解 （3） RNA的纯化及获得
RNA提取流程－－ 样品前处理注意点
选择新鲜血液，不得超过4小时
选择新鲜组织，生长旺盛的组织
选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞
RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本
可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间
RNA降解
难避免 RNA 的降解。
建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更 多裂解液。
RNA降解
冷冻样品：
样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 -70℃冰箱保存。样品要相对小一点；
先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；
样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须 预冷，碾磨过程中及时补充液氮。
推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存
液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间
RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA
异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂
胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂
RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得
RNA纯化要求
1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质
2 排除有机溶剂和金属离子的污染
3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染
2. RNA提取的注意事项 杜绝外源酶的污染 a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆， 电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须 确保 RNase-Free。
75% 乙醇洗涤
样品中杂质的残留
多糖等杂质，再次沉淀
DNA 污染
使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA
RNA的保存
短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmol／L Tris， 1mmol／L EDTA)或无：RNA酶水(0.1mmol／L EDTA)中， 保存于一20℃。在保存RNA样品时，通常使用EDTA来螯 合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，许多实验室 配制EDTA后常使用很长时间甚至数年，这种长期使用的 EDTA溶液常有微生物存在，反而会造成RNA酶的污染。 中长期保存：相对于一20℃，一80℃可进一步防止RNA 降解。可将RNA溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中，保存 于一80℃，通常可保存6个月左右。 长期保存：保存RNA最为稳定的方法是经乙醇沉淀后，直 接保存于一80℃(在纯化RNA的清洗步骤中，离心后不要 弃上清，将RNA保存于乙酸铵／乙醇溶液中)。对于已经 纯化好的RNA，如果为离心后的RNA沉淀，可加入70％ 乙醇，保存于-80℃。如果为溶解于TE缓冲液或无RNA酶 水中的RNA样品，可加入2倍体积的无水乙醇，保存于80℃。
复习核酸的提取方法
核酸的沉淀 DNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5. 收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异 丙醇沉淀。 在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也 能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析 出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇 能沉淀出蛋白。
Trizol 试剂提RNA的原理
OD260 /OD280 比值偏低
抽提试剂残留：
确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。

解决办法:再沉淀一次后，溶解。
设备限制：
测定 OD260 及 OD280 数值时，要使 OD260 读数在 0.10 - 0.50
之间。此范围线性最好。
用水稀释样品：
测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用 水作为稀释液将导致比值的降低。
TRIzol法提取流程
5 .4 ℃ 离心， 13000g × 10min ，弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打 碎。 4 ℃ ， 13000g × 5min ，弃上清。 7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎) 8. 晾干，加入适量的 H 2 O 溶解（100ul） （ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。 9.定量。
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂 。Trizol中含苯酚和异 硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试 剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性， 裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分 离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后， RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层 后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式 还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层 中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
来自百度文库
不同丰度
组织名称 肝脏
样品 量
1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg
总RNA含量
2 RNA分布
高丰度
脾脏 心脏 大脑 胚胎 肾脏 肺
2-4μg
中丰度
0.05-2μg
膀胱
低丰度 骨 脂肪 高丰度 中丰度 低丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片
1mg
1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.5-1μg 0.5-1.5μg 0.2-0.5μg 0.05-0.1μg 0-0.05μg
实验一、RNA提取方法及原理
一、研究背景
二、方法及原理
一、研究背景
1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物 大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的 遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在 信息传递中起很重要的作用。其它两大类 RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物 合成中发挥不可替代的重要功能。因此 mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传 递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足 轻重。
阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。
明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时， 抽提成功率急剧下降。 b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实 验的一次成功，而不是得率。
Rnase 污染的10大来源
1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8： RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶
实验流程图
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
有机相
pH5.7
RNA提取常见问题
RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低
电泳带型异常
下游实验效果不佳
新鲜细胞或组织：
裂解液的质量
外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很
复习核酸的提取方法
RNA的提取 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振 荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂
复习核酸的提取方法
DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少 量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提 取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro
TRIzol法提取流程 1. 样品处理： 组织：取 100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中 保存的组织均可）置匀浆器中 ，加入 1ml Trizol 充分匀浆，匀浆液转1.5ml 离心管中,室温静置５ min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 .4 ℃ 离心， 13000g × 15min ，取上清。 4 .加入 与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液体 轻轻混匀，室温静置 20min (-20 ℃，时间长效 果更好)。 取200-300ul从5步往下做。
电泳带型异常
非变性电泳：
上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧， 均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。
变性电泳条带变淡：

EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，
变性电泳比非变性电泳要淡一些；
甲醛的质量不高 。
下游实验效果不佳
RNA 降解
抽提试剂的残留
OD260 /OD280 比值偏低



蛋白质污染：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
减少起始样品量，确保裂解完全、彻底

解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。


苯酚残留：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。