体内药物分析方法的建立和验证参考课件
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B:用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物 质的干扰
1.内源性物质的干扰
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A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰
B:比较的内容 Tr；n；T；R 2.代谢产物干扰
比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T； R），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.配伍用药的干扰 A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物 模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检 测信号
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B:根据已知的分析方法进行测定 C:根据测定结果确定最佳条件：溶液pH值；温度及时间；试剂
用量；色谱条件
2.分析条件的选择
1）空白溶剂试验 A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方 法的特异性 B:空白响应值应尽可能小或可忽略
2）空白生物基质试验 A:取空白生物基质（血、组织匀浆），照空白溶剂试验下操作 B:考察杂质对测定的影响 C:杂质不干扰测定
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B:比较的内容 Tr；n；T；R 4.与参比方法的相关性
A:参比方法选择（HPLC、GC） B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品 C:参比方法测得值为横坐标（x），拟定的方法测得值为纵座
标 （y），求回归方程y=a+bx，r为一致成度；a为拟定方法 受恒定干扰程度；b为拟定方法受比例干扰程度。 D: r=1 a=0 b=1 两种方法一致
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第三节 分析方法的验证内容和要求
一.分析方法的选择
A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行 性，应使用若干技术指标验证
B:验证步骤 分析方法验证；实际生物样品中药物测定 一）特异性：又称专属性、专一性，与选择性互用
A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表 示所检测的信号应属于待测物所特有
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1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取 2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好 3）药物浓度过低采用高灵敏度方法
2.分析测定的目的与要求
1）药代动力学研究 A:测定血中的药物和代谢物 B:要求较宽的线性范围（Cmax/Cmin 1/10-1/20） C:较高的灵敏度（10-9g/ml）、准确度 D:分离度大于1.5 E:常用的仪器HPLC、GC、LC-MS
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百度文库
3）模拟生物样品试验 A:取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品 B:照空白生物基质试验下操作 C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏 度；萃取回收率 4）实际生物样品测定 A:预试 确定实际生物样品与模拟生物样品一致性 B:正式试验 按所建立的分析方法分析 C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点 D:计算体内药物浓度
2.内标物溶液的配制
1）精称内标物适量，配内标物贮备液
2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液
3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度
3.标准系列模拟生物样品的配制
1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入 内标液适量），混匀
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2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和
二）标准曲线与线性范围
A:又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测 定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。
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B:大多数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法 和加权最小二乘法
C: 生 物 样 品 中 药 物 浓 度 为 自 变 量 （ x ） ， 检 测 信 号 为 因 变 量 （y），回归方程为y=a+bx，r为相关系数 D:线性范围，浓度不能外推 E:标准曲线模拟生物样品的生物基质应使用与待测的实际生物
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5.限度要求
1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1，
HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100）
三）准确度
指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
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2）血药浓度监测 A:要求线性在有效浓度范围内 B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定 C:常用的仪器TDX
3.生物样品的类型与样品制备方法
A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系 B:血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取技术，HPLC测定 C:用RIA时样品的预处理可粗放 4.试验室条件 A:试验室设备 B:试验人员
样品的生物基质相同
1.标准曲线系列溶液的配制
1）精称标准药物适量，配贮备液
2）精量配贮备液适量，配制系列标准溶液
3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍
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4）加量为生物样本体积的2% 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干 6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加 7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2
内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质
4.标准曲线的绘制
1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比 （A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓 度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性 良好。
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C:验室SOP D:分析软件
第二节 分析方法建立的步骤
一.分析方法的选择
A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素 B:样品中的药物浓度10-6-10-9g/ml C:HPLC法检测限：紫外（UV）1ng；荧光0.1ng；电化学（EDD） 0.01ng 二.分析方法的建立 1.检测条件的筛选 A:取标准物质 待测物质；内标物质
第四章 体内药物分析方 法的建立与验证
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第一节 分析方法的设计依据
一.待测药物的理化性质及体内存在状况
1.待测药物的理化性质 1）待测药物的pKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数
等决定萃取方法 2）药物挥发性判定是否GC检测 3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法 4）药物酸碱、光、热的稳定性 2.待测药物的体内状况
1.内源性物质的干扰
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A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰
B:比较的内容 Tr；n；T；R 2.代谢产物干扰
比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T； R），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.配伍用药的干扰 A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物 模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检 测信号
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B:根据已知的分析方法进行测定 C:根据测定结果确定最佳条件：溶液pH值；温度及时间；试剂
用量；色谱条件
2.分析条件的选择
1）空白溶剂试验 A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方 法的特异性 B:空白响应值应尽可能小或可忽略
2）空白生物基质试验 A:取空白生物基质（血、组织匀浆），照空白溶剂试验下操作 B:考察杂质对测定的影响 C:杂质不干扰测定
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B:比较的内容 Tr；n；T；R 4.与参比方法的相关性
A:参比方法选择（HPLC、GC） B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品 C:参比方法测得值为横坐标（x），拟定的方法测得值为纵座
标 （y），求回归方程y=a+bx，r为一致成度；a为拟定方法 受恒定干扰程度；b为拟定方法受比例干扰程度。 D: r=1 a=0 b=1 两种方法一致
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第三节 分析方法的验证内容和要求
一.分析方法的选择
A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行 性，应使用若干技术指标验证
B:验证步骤 分析方法验证；实际生物样品中药物测定 一）特异性：又称专属性、专一性，与选择性互用
A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表 示所检测的信号应属于待测物所特有
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1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取 2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好 3）药物浓度过低采用高灵敏度方法
2.分析测定的目的与要求
1）药代动力学研究 A:测定血中的药物和代谢物 B:要求较宽的线性范围（Cmax/Cmin 1/10-1/20） C:较高的灵敏度（10-9g/ml）、准确度 D:分离度大于1.5 E:常用的仪器HPLC、GC、LC-MS
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百度文库
3）模拟生物样品试验 A:取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品 B:照空白生物基质试验下操作 C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏 度；萃取回收率 4）实际生物样品测定 A:预试 确定实际生物样品与模拟生物样品一致性 B:正式试验 按所建立的分析方法分析 C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点 D:计算体内药物浓度
2.内标物溶液的配制
1）精称内标物适量，配内标物贮备液
2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液
3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度
3.标准系列模拟生物样品的配制
1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入 内标液适量），混匀
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2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和
二）标准曲线与线性范围
A:又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测 定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。
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B:大多数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法 和加权最小二乘法
C: 生 物 样 品 中 药 物 浓 度 为 自 变 量 （ x ） ， 检 测 信 号 为 因 变 量 （y），回归方程为y=a+bx，r为相关系数 D:线性范围，浓度不能外推 E:标准曲线模拟生物样品的生物基质应使用与待测的实际生物
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5.限度要求
1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1，
HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100）
三）准确度
指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
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2）血药浓度监测 A:要求线性在有效浓度范围内 B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定 C:常用的仪器TDX
3.生物样品的类型与样品制备方法
A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系 B:血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取技术，HPLC测定 C:用RIA时样品的预处理可粗放 4.试验室条件 A:试验室设备 B:试验人员
样品的生物基质相同
1.标准曲线系列溶液的配制
1）精称标准药物适量，配贮备液
2）精量配贮备液适量，配制系列标准溶液
3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍
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4）加量为生物样本体积的2% 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干 6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加 7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2
内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质
4.标准曲线的绘制
1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比 （A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓 度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性 良好。
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C:验室SOP D:分析软件
第二节 分析方法建立的步骤
一.分析方法的选择
A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素 B:样品中的药物浓度10-6-10-9g/ml C:HPLC法检测限：紫外（UV）1ng；荧光0.1ng；电化学（EDD） 0.01ng 二.分析方法的建立 1.检测条件的筛选 A:取标准物质 待测物质；内标物质
第四章 体内药物分析方 法的建立与验证
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第一节 分析方法的设计依据
一.待测药物的理化性质及体内存在状况
1.待测药物的理化性质 1）待测药物的pKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数
等决定萃取方法 2）药物挥发性判定是否GC检测 3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法 4）药物酸碱、光、热的稳定性 2.待测药物的体内状况