20170814 质粒构建流程

20170814
质粒构建流程
武汉大学Angelo
一、引物设计
1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI
2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pMSCV，
4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取
方法一：
1. RNA提取
2. RNA反转录获得目的片段
方法二：
从韩家淮实验室索取（通常采用）
具体流程：
1、PCR扩增PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle 72℃5min 22℃保存注：可根据不同
基因调节退火温度，延伸时间，循环数。

2、PCR产物纯化
1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min
2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。

② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min
左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥ 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期⑧电泳检测
三、载体和片段双酶切（分开酶切）20μl 反应体系如下
片段：PCR纯化产物16μl FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反
应条件：37℃水浴2h 加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用
的酶具体选择
载体：载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h或以上加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择
四、载体酶切产物回收和纯化
片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化
1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制：琼脂糖凝胶（1%）30ml 琼脂糖粉0.3g 1×TAE 30ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板，插梭子。

）
2）割胶回收（产物电泳结果含从载体上切下来的杂带）① 将含载体条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。

② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥ 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min 标上载体名称，酶切位点名称，日期（片段同此相同）⑧电泳检测
五、连接
一般15μl（20μl）连接体系：
片段：载体=4:1=12.5ul（也要考虑到载体回收浓度）10×T4 buffer 1.5μl T4 ligase 1μl PCR仪中进行：22℃，1h（根据所连接上的片段大小进行选择连接时间）4℃冰箱过夜保存或当天进行转化注：连接产物-20℃可长期保存
六、转化
准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min 4）热击水浴42℃，90s，冰浴1min 5）加900μl LB空培养基，摇菌80rpm，37℃，1h-2h 6）浓缩离心2500-3500rpm，2min，去清液留约200μl 重悬管底菌体，涂板7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h
七、菌落PCR挑选阳性菌
1）挑单克隆菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。

新划的板37℃倒置培养12-16h。

2）以mix混合液（2×）（含酶，Buffer，dNTP等）20μl 体系配制菌落PCR反应液PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大
小设定时间）25-30 cycle 72℃5min 22℃保存注：程序与DNA扩增一样
3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。

八、测序
1. 摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37℃。

250rpm摇菌12-16h
2. 送样每瓶取1ml菌液，送华大基因测序
3. 比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。

（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）
九、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。

1）超净工作台中取1.5mlEP 管，加200μl 80%灭菌甘油。

2）再加入800μl 箘液，轻混匀。

3）液氮冻存。

（一个基因冻2管即可）
十、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，剩余菌液用于提取质粒。

试剂盒抽提质粒。