细菌内毒素检测方法验证方案 定稿

细菌内毒素检测方法验证方案

起草人：

审核人：

批准人：

生效日期：

文件分发范围：QA、QC

1.验证目的：

为确保细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，

特制定此验证方案。

2.验证范围：

适用于注射液细菌内毒素检测方法验证。

3.验证小组成员及职责：

组长：，QC经理，负责协调小组的行动，跟进验证方案的审批流程，协调与其他部门及小组成员内的交流，组织验证数据并文件化。

组员：，QC人员，负责起草方案并按照确认方案进行验证，起草验证报告。

组员：QC微生物主管，负责验证方案与报告的审核，验证过程的复核。

4.验证依据：

4.1《药品生产质量管理规范》（2010年修订）

4.2《药品生产验证指南》(2003年版)

4.4《细菌内毒素检验操作规程》（SN-O08-F0061-02）

4.5《中国药典2010版二部》附录

5.验证前准备：

5.1人员培训确认：

检查人：日期：复核人：日期：

5.2仪器设备

5.3检验材料、试剂及标准品

6. 鲎试剂灵敏度复核：

以上该批鲎试剂按《细菌内毒素检查法操作规程》（SN-O08-F0061-02）检查法的要求复核标示灵敏度，应符合规定。

《鲎试剂灵敏度复核记录》（SN-O08-F0061-R02-01）编号：。

灵敏度复核结果： EU/ml

7.验证方法：

通过比较内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素（BET）检查有干扰，至少对3批样品进行干扰试验。

7.1供试品细菌内毒素限值和最大稀释倍数的确定（L）：

7.1.1限值：每1mg中含细菌内毒素的量应小于30EU

7.1.2供试品的最大有效稀释倍数（MVD）公式：

MVD＝C*L/λ

式中：C为供试品溶液的浓度（为2.5mg/ml），其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位为mg/ml或U/ml，λ为鲎试剂的灵敏度。

7.1.3最大有效稀释倍数（MVD）计算结果：

MVD＝CL/λ

＝（2.5mg/ml*30EU/mg）/0.25 EU/ ml

＝ 300倍

7.2干扰试验

7.2.1细菌内毒素标准溶液制备：

取细菌内毒素工作标准品（160EU/ml）一支，开启，加入1ml 细菌内毒素检查用用水溶解，置旋涡混合器上混合15分钟，得到160EU/ml的内毒素标准溶液（以E

160

表示），用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。具体稀释过程如下:（选用灵敏度λ=0.25的鲎试剂进行实验）

1mlBET 0.2mlE

160 0.2mlE

16

1.0ml E

8

1.0mlE

1

1.0mlE

0.5

E

160/支 E

160

E

16

E

1.6

E

1

E

0.5

1.8mlBET 1.8mlBET 0.6mlBET 1.0mlBET 1.0mlBET

1.0mlE

0.25 1.0mlE

0.125

E

0.25 E

0.125

E

0.0625

1.0mlBET 1.0mlBET

7.2.2供试品溶液的制备

直接将供试品按最大稀释倍数稀释，即稀释300倍,供试液浓度为S

300

。稀释步骤如

下：

0.2ml 0.5ml 5.0ml

S 原液 S

10

S

150

S

300

1.8ml 7.0ml 5.0ml 7.

2.3含内毒素的供试品溶液的制备

用供试品溶液将7.2.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度2λ（E

0.5）、λ（E

0.5

）、

0.5λ（E0.5）、0.25λ（E0.5）的含内毒素的供试品溶液。

1mlBET 0.2mlE

160 0.2mlE

16

1.0ml E

8

1.0mlE

1

1.0mlE

0.5

E

160/支 E

160

E

16

E

1.6

E

1

E

0.5

1.8ml S

300 1.8ml S

300

0.6ml S

300

1.0ml S

300

1.0ml S

300

1.0mlE

0.25 1.0E

0.125

E

0.25 E

0.125

E

0.0625

1.0ml S

3001.0ml S

300

注：每步稀释前被稀释液应置于旋涡混合仪上混合至少30秒。

7.2.4鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，70%异丙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

7.2.5加样

（1）将准备好的规格为0.1ml/支鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ（E0.5）、1.0λ（E0.25）、0.5λ（E0.125）、0.25λ（E0.0625）的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

（2）将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）分别加入0.1ml S

300

供试品溶液作为供试品对照。

7.2.6加样结束后，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37±1.0℃试管恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。

7.2.7试验结果记录（阳性表示为“+”；阴性表示为“-”）：

见附件《干扰试验记录》。

7.2.8试验结果计算

如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性