植物组织培养实验基本步骤。。

植物组织培养实验基本步骤

一、母液的配置

1、MS大量元素母液的配制

将大量元素配制成10倍的母液,使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的:NH4NO3 8、250g 、KNO3 9、500g 、KH2PO4 0、850g 、 MgSO4·7H2O 1、850g 、CaCl2·2H2O 2、20g,所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,最后定容至500ml,转入500ml 细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。

2、MS微量元素母液的配制

将微量元素配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取:MnSO4· 4H2O 1、1150g 、ZnSO4·7H2O 0、4300g 、 H3BO3 0、3100g 、KI 0、0415g 、CuSO4·5H2O 0、00125g、 CoCl2·6H2O 0、00125g,用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,用容量瓶定容至500ml,转入500ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。

3、MS铁盐母液配制

将铁盐配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的:称 FeSO4·7H2O 1、

390g与Na2·EDTA 1、865g,把FeSO4·7H2O与Na2·EDTA·2H2O分别置于200ml蒸馏水中,加热并不断搅拌使之溶解(磁力搅拌器,边加热,边搅拌)。保持加热,把FeSO4溶液慢慢倒入Na2·EDTA溶液中并不断搅拌,接近沸腾时停止加热,待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml,置于棕色细口瓶中,用力振荡1～2min,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后,再置于4℃冰箱中保存备用。

4、MS有机化合物母液的配制

将有机化合物配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的:肌醇 5、000g 、维生素B1 0、025g 、烟酸 0、025g 、甘氨酸 0、100g 、维生素B6 0、005g 、蔗糖 15、000g ,用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后,转入500ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。

二、植物激素的配置

常见激素:二氯苯氧乙酸(2,4－D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚－3－丁酸(IBA)、激动素(6-糠氨基嘌呤、 KT)、6－苄氨基嘌呤(6－BA)、赤霉素(GA3)、

1、生长素类:

(1)、生长素类在组织培养中的主要作用就是:诱导细胞的分

裂与根的分化,诱导愈伤组织

(2)、常见生长素:二氯苯氧乙酸(2,4－D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚－3－丁酸(IBA)。NAA、IAA、IBA被广泛用于生根,2,4－D有利于愈伤组织的诱导与生长。IAA容易光解,注意用棕色试剂瓶保存,保存时间不要太久。

(3)、溶解方法:称25mg吲哚乙酸(IAA),用少量1mol/L NaOH 或95％酒精预溶解,再加蒸馏水定容至25ml,摇匀。

(4)、保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存

2、细胞分裂素

组织培养中,细胞分裂素主要促进细胞分裂与由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化与器官形成。(1)、常用的细胞分裂素有: 6－苄氨基嘌呤(6－BA)、激动素(6-糠氨基嘌呤、 KT)、玉米素(ZT)、噻二唑苯基脲(TDZ ) (2)、溶解方法:称25mg 6－苄氨基嘌呤(6－BA),用少量(1ml)1mol/L HCL预溶解,再加蒸馏水定容25ml,摇匀。(3)、保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存

3、赤霉素(GA3)

(1)、溶解方法:用少量95％酒精预溶解,再加蒸馏水定容。

(2)、保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存

(3)、赤霉素易溶于水,但溶于水后不稳定,容易分解

(4)、灭菌:高温易分解,要过滤灭菌

4、脱落酸

(1)、溶解:易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。

(2)、保存:具有热稳定性,但容易发生光解。配成一定浓度后,冰箱冷藏保存

三、培养基的制备与灭菌

(一)、培养基的制备

1、将所需的各种母液与植物激素按顺序放好,将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水,按照培养基配方所需量依次取母液加入烧杯,搅拌,按相应培养基称量蔗糖与琼脂,并添加到烧杯中,在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。

3、充分混合后,用1mol/LNaOH与1mol/LHCl调节培养基的pH为5、6-5、8(可将其调为6、0),趁热把培养基分装到广口瓶中,封好瓶口,待灭菌。

(二)、培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间:121℃(1、06kg/cm2)下灭菌20分钟。(如就是实验所用菌材灭菌,如无菌水及器械,则就是121℃(1、06kg/cm2)下灭菌30分钟),此时可将需要灭菌的实验仪器一起灭菌。

1、检查灭菌锅外层锅内水位,水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

2、盖上锅盖,注意按照说明操作并确定已盖好,设置好温度与时间参数,开启电源加热灭菌。

3、灭菌时间到后,先切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,待灭菌锅压力表指针降到0时,打开排气阀,旋松螺栓,开启锅盖,取出已灭菌的培养基。

4、在培养基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口,放置在水平桌面上自然冷却。

四、无菌操作技术与接种

1、接种前,用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面,将培养基及接种用具放入超净工作台台面,打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯,照射约30min,然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板,通风20min后,即可进行无菌操作。(此步由专人统一负责)

2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净,吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中,用蒸馏水冲洗2次,倒掉蒸馏水后倒入0、1%的升汞水消毒,将材料淹没浸泡约10分钟(期间用镊子搅拌几次)。

3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中,用无菌水清洗3次,每次不少于1分钟,洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。最后一次清洗后转移到无菌托碟上,将接种材料切