第三章抗生素发酵生产工艺

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5.1青霉素生产菌的特性
菌种：产黄青霉
生长发育分七个阶段：
点青霉
Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期，适宜做种子；
Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；
Ⅵ期：菌丝体自溶期。
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青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期 菌丝繁殖期 脂肪粒形成期
脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶
菌丝生长期
青霉素分泌期 菌丝自溶期
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发酵培养下的生长过程及细胞学变化
青霉素的抗菌效力与其分子中的β-内酰胺环有关。
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抗菌作用和临床应用
青霉素主要抑制G+菌，但对某些G-菌，螺旋体及放线菌也 有强大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合 成有关。
青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、 骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及 肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。
操作方式：反复分批式发酵 发酵罐： 100m3，装料80m3. 带放: 6-10次，带放量10％，间隔24h。 发酵周期：180-220h
发酵过程需连续流加葡萄糖、硫酸铵以及前 体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指 标，不同时期分段控制。
过程控制——补料分批操作控制基质浓度
前40小时：培养基中的主要营养物 40小时后：低速连续补加葡萄糖、
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“后抗生素时代”
如果不再控制抗生素的滥用状态，二十一世纪 人类有可能失去抗生素这个有利的治疗武器， 重新回到没有抗生素的时代，所谓“后抗生素 时代”。
后抗生素时代是倒退，我们可能回到没有药物 可使用的状态，大量的传染性疾病将危害人类 的身体健康和生命。虽然这是一种悲观的想法， 但悲观的很有道理，细菌产生耐药速度比新药 物开发的速度快得多，这是一个确实的现象。
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（2）抗生素的命名（一般分为三类）
按生物的来源：凡是在动、植物或微生物产生的，可按来源命 名。如青霉素、赤霉素、蒜素
按化学结构命名：化学结构性质清楚的，如四环素（含有四并苯 的基本母核），氯四环素（金霉素），氧四环素（土霉素）。
名称
R1
R2
微生物来源
四环素
H
H
金色链霉菌
金霉素
H
OH
金色链霉菌
土霉素
米孢子：移植到小米或大米固体培养基 上，生长7天，25℃
注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试 验，测定效价及杂菌情况。
(2)、种子罐培养工艺
一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。 培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫 剂等。 空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300-350rpm； pH自然，温度27±1℃, 40h 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10％ 培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。 通气量1:1-1.5；搅拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。 10-14h 质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h
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2 抗生素的发展简史
2.1治疗和发展
我国的发展：
1953年5月1日，建立了第一个生产青霉素的抗 生素工厂（上海第三制药厂）；
1958年6月3日，最大的抗生素联合企业建成投 产（华北制药厂,石家庄），也是青霉素发酵总容积 居世界首位。
目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药 的剂型方面与国外相比差距很大。
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抗生素滥用的重灾区
中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国：年产抗 生素原料大约21万吨，出口3万吨，其余自用（包括医 疗与农业使用)，人均年消费量138克左右(美国仅13 克)。
2011年4月7日是世界卫生日，首届合理用药大会在这 一天召开，恰好契合了世界卫生日的主题——“抵御耐 药性：今天不采取行动，明天就无药可用”。
（5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉 素。
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3.5 根据抗生素的合成途径分类
（1）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢 菌素等寡肽抗生素。 （2）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。 （3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等 丙酸衍生物。
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4 抗生素的生产工艺
氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。 半饥饿状态：延长合成期，提高产量。 碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。
生产方法： 1、生物合成法： ①传统方法 ② “工程菌”制造法 ③细胞融合技术法 2、化学合成法； 3、生物合成加化学合成法。
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1、生物合成法：
①传统方法
大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种 是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风 搅拌发酵罐生产。
传统方法目前存在很多不足，因此，人们 采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行 了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的 新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增 长。
镜检控制Biblioteka Baidu
规定时间取样，显微镜观察7 个时期的 态变化，控制发酵。 1 －4 期为菌丝生长期，3 期的菌体适宜 种子。 4－5期为生产期，生产能力最强，通过 工程措施，延长此期，获得高产。 第6期到来之前结束发酵。
6.青霉素发酵工艺过程
6.1青霉素生产流程
发 冷冻干燥孢子
琼脂斜面
酵 工 带放补料
培养基制备
（2）生产菌的生物学特性 （3）发酵工艺过程
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1 抗生素的定义和命名 （1）抗生素的定义
早期：一般认为来源于微生物，且主要作 用于细菌感染。故认为抗生素(antibiotics)是微 生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制 它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物 的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我 们曾经把这类物质叫做抗菌素。
第1期：分生孢子萌发，具有小泡。 第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。 第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体 消失，青霉素产量最高。
第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨， pH上升。
第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。
提取阶段
成品检验 成品包装
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5 青霉素概述
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青霉素的理化性质
青霉素本身为一元酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和 铵等化合成盐类。
易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有 机溶剂。
游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌效 力。
不耐热，一般保存于冰箱中，但青霉素盐的结晶纯 品，在干燥条件下可于室温保存数年。
艺
发酵罐
冷至15℃
无菌空气
提 炼
预处理罐
工
艺 工业盐
过滤器 结晶器
米孢子 种子罐 1和2 萃取器 蒸发器
6.2 青霉素发酵工艺过程
(1)、生产孢子制备
斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固 体培养基进行培养，最适温度25-26 ℃，培养6-8天，形 成单菌落。再传斜面，培养7天，形成绿色斜面孢子。
Cl
H
龟裂链霉菌
其它：纪念意义、产地、俗名如正定霉素、井冈霉
素、金霉素和土霉素等。
7
H
RN
H
O
S CH3
CH3
N
COO-
H
-lactam ring β-内酰胺 环
natural penicillin R =
CH2-CO-
8
β-内酰胺 环
氨 苄青霉素 苯氧甲基青霉素 羧苄青霉素 苯甲异噁唑青霉素
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② “工程菌”制造法
第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦 迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部 分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌” 产生了全新的抗生素。
我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程 菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获 得的。新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小， 对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。
现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠 杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药 物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生 素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。
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抗生素制备的一般流程图
菌种
前体
孢子制备 种子制备
发酵
发酵阶段
发酵液预处理及种子加滤 提取及精制
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（3）细菌产生的抗生素：如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。 如多粘菌素。
（4）植物或动物产生的抗生素：从被子植物蒜中制得的蒜素；从 动物脏器中制得的鱼素等。
3.2根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家） （1）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G（2）抗G+的抗生素：如青霉素， （3）抗G-的抗生素：如链霉素 （3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素 （4）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒 有一定作用。
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③细胞融合技术法
对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为 突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原 菌株提高140倍。
目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素 等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更 多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。
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2、化学合成法
根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化学 合成的方法，可生产部分抗生素。
(3)、生产罐培养工艺
三级罐：生产罐；接种量20％ 培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，
硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油. 参数条件：
通气量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小时:pH6.4-6.6，26℃； 60小时后: pH6.7, 24℃。
6.3 发酵培养与过程控制
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3.4 根据作用机制分类
此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了解抗 生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规 律，使抗生素的使用更为合理。
（1）抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素。
（2）影响细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素。
（3）抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：四环素。
（4）抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝 裂霉素C。
（5）抗癌的抗生素：如阿霉素
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3.3根据抗生素的化学结构分类（化学家） 较复杂，目前已确定结构的抗生素习惯如下分类： （1）β-内酰胺类抗生素：包括青霉素类，头孢菌素类等 （2）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等 （3）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素 （4）四环类抗生素：如四环素、土霉素 （5）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽 （6）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素 （7）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星
第十一章 抗生素发酵生产工艺
主讲教师：生科院洪军
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知 识
1.制药微生物生产菌种如何选 育？发酵过程中主要检测的
回
参数有哪些？
顾 2.发酵工艺过程如何控制？
2
主要内容
抗生素的概述： （1）抗生素的定义 （2）抗生素的命名 （3）抗生素的分类
青霉素的发酵生产工艺：（重点） （1）青霉素的概述
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3 抗生素的分类
可根据生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物 合成途径等方面对抗生素进行分类。 3.1 根据抗生素的生物来源分类 (生物学家) （1）放线菌产生的抗生素：如链霉素、四环类（如四环 素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素） 、 放线菌素类（如放线菌素D）等。（其中链霉菌属最多，诺 卡氏菌属、小单孢菌次之） （2）真菌产生的抗生素：如青霉菌属和头孢菌属等分别产 生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。
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现在：
来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生 素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、 常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等） 、动物 （如鱼素、红血球素等） 。但抗生素的工业化生产主 要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台 上的主角。
作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生 虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为 抗菌药物。
如：氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的不断
深入研究，越来越多的抗生素可用化学合成法生 产。
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3、生物合成加化学合成法
许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因 子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌 日益增多，抗生素疗效就越来越低。
为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行 了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制 或杀死。
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定义：虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗 生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一 直存在着分歧。
目前，一个大多数专家所接受的定义是： 抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动 物在内）在其生命活动过程中产生的或（化学 合成获得的），能在低浓度下有选择地抑制他 种生物机能的低分子量的有机物质。
狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生 物代谢产物，能在很低的浓度下抑制其他微生 物的生长。