酶分子的定向进化

第七章酶分子定向进化

酶的蛋白质工程

蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子进行设计和改造。

蛋白质的功能基础

蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。

酶的蛋白质工程

现在对天然酶性质的改造主要包括以下几个方面：

1）改变酶的动力学性质以改变其催化效率；

2）取代活性部位的氨基酸残基，研究其对整个酶分子功能及稳定性的影响；

3）提高酶在非水溶剂中的稳定性和活性，目前主要是针对极性有机溶剂；

4）增强酶的专一性，减少副反应；

5）改变酶的最适温度和最适pH值；

6）增强酶抗氧化和抗水解能力，延长体内半衰期；

酶的蛋白质工程

原则上任何有功能的酶都可用蛋白质工程加以改造，但实际上选择目标时需考虑几个因素：1）有没有测定空间结构或者有没有已知结构的同源蛋白质；

2）结构功能关系是否明确；

3）所选对象有何经济效益和社会效益；

4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。

蛋白质结构的测定

运用X-射线衍射测定蛋白质晶体结构

核磁共振测定溶液中蛋白质三维结构

同时运用几种结构测定方法获取蛋白质结构的数据

建立数据库

蛋白质结构测定

一级结构测定：

直接法

间接法

三级结构测定：

X-射线晶体衍射

核磁共振(NMR)光谱

X-射线衍射技术：

蛋白质工程的主要手段

蛋白质的分子设计

蛋白质的分子设计就是为将要改造的蛋白质提供设计方案。

对蛋白质的分子设计分为三类：

（1）小改——少数残基的替换；

（2）中改——分子剪裁；

（3）大改——全新设计。

酶的蛋白质工程

定点突变

酶的定向进化

酶的定向进化

属于蛋白质的非理性设计

不需事先了解酶的空间结构和催化机制

人为地创造的进化条件，模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择)

在体外改造酶基因

定向选择(或筛选)出所需性质的突变酶。

定向进化的原理

基本规则是“获取所筛选的突变体”。

定向进化=随机突变+选择。

通过随机突变和（或）基因体外重组创造基因多样性

导入适当载体后构建突变文库

通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子

第一节酶基因的体外随机扩增

酶突变基因获得主要采用随机诱变和基因体外重组。

随机诱变可以通过易错聚合酶链式反应（error-prone PCR）、化学诱变、紫外辐射、有毒核苷插入法等来完成。

基因体外重组可以使用：DNA改组(DNA shuffling)、随机引导重组、交错延伸法、随机延伸诱变等多种方法。

一、易错PCR

从单一基因出发，通过改变PCR反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。

条件：

增加Mg2＋（稳定非互补的碱基对）

添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性）

4种底物的浓度不平衡

连续易错PCR

将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。

不足之处

遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化；

靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；

中性突变较多；

较为耗时、费力；

获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。

二、DNA改组技术(DNA shuffling)

又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。

通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。

优点

可以利用现存的有利突变，快速积累不同的有利突变；

对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；

从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；

比随机突变显著提高了良性突变的概率，1%→13%；

可伴随点突变同时发生。

改进——1、交错延伸重组

改进——2、随机引物体外重组法

第二节酶突变基因的定向选择

定义：是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。

过程：突变基因与适宜的载体进行重组

组装形成突变基因文库（细胞或噬菌体）

通过高通量筛选技术获得目的基因

目的基因表达获得所需进化酶

突变基因文库的构建

质量要求：包容性、完整性

过程：

选择合适的载体

（质粒、噬菌体、黏粒、噬菌粒）

基因重组

（DNA连接酶连接突变基因和载体DNA）

组装突变基因文库

（转入受体细胞或包装成有感染活性的重

组噬菌体）

突变基因的筛选

根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件

高通量筛选技术

特点：通量大、效率高

（短时间内简便地对大量突变进行判断）

方法：平板筛选法

荧光筛选法

噬菌体表面展示法

细胞表面展示法

核糖体表面展示法

定向进化示意图

随机突变+定向选择＝目标突变体

定向进化的选择策略

选择特定方向的突变限定了进化趋势，加快了酶在某一方向的进化速度。

筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。

选择合适高通量的筛选体系。

酶分子定向进化的作用

提高酶的催化效率

增强酶的稳定性

改变酶的底物特异性

体外定向进化的意义

蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶定向进化的基本先决条件。属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，体外改造酶基因，定向选择出所需性质的突变酶。