细胞成像

100% Methanol
4% PFA
例：Anti-EGFR (phospho Y1068) antibody [Y38] (ab32430)
23 November 2018
细胞成像的实验流程
样本通透
固定
fixation
通透
permeabilization
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
抗体的金标准
特异性
敲除验证： ~ 1500个产品结果 Wild-type HAP1 cells
Ki67 knockout HAP1 cells
CRISPR/Cas9 genome-editing
-
Anti-Ki67 antibody [EPR3610] (ab92742) Anti-alpha Tubulin抗体[DM1A] - Microtubule Marker (Alexa Fluor® 594) (ab195889)
•
•
封闭非特异性结合可用10% 血清，5% BSA, 或 Protein Block (ab156024)；
使用Biotin标记物,需要封闭内源Avidin、Biotin, 可用Endogenous Avidin/Biotin Blocking Kit (ab64212)；
•
使用荧光标记物, 当使用甲醛固定时，用含0.3M 甘氨酸的封闭液封闭, 也可以选用相 应的荧光蛋白封闭液, 如FITC Protein Blocking Agent (PBA) (ab128980)
封片剂
• 维持样品状态，防止样品变干 • 防荧光淬灭 • 高折射率（Refractive Index），
提高图像的分辨率；
含DAPI的防荧光淬灭封片剂 ab104139
23 November 2018
抗体质量问题
抗体质控的金标准
特异性
敲除验证
RabMAb® 抗体
灵敏度
一致性
重组技术
23 November 2018
23 November 2018
细胞成像的实验流程
样本固定
交联试剂
甲醛溶液 多聚甲醛 戊二醛
有机溶剂
甲醇 乙醇 丙酮
•
•
交联试剂有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，可能会降低抗原性
预冷的有机溶剂固定会吸去脂类使细胞脱水、蛋白变性，这种固定方法不需要额外的通透步骤
23 November 2018
• •
23 November 2018
细胞成像的实验流程
复染和封片
固定
fixation
通透
permeabilization
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
23 November 2018
抗体的金标准
灵敏性
RabMAb：~13000个产品结果
High
Kd distributor
Affinity
Rabbit Poly
RabMAb
Low Low
Mouse mAb
High Specificity
23 November 2018
抗体的金标准
灵敏性
CDX2 E-Cadherin Her2
23 November 2018
细胞成像的实验流程
一抗孵育
固定
fixation
通透
permeabilization
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
Xu et al, Nature, 2008
23 November 2018
细胞成像讲座内容
1. 细胞成像的发展和原理 2. 细胞成像的实验流程 3. 细胞成像的实验设计 4. 细胞成像的常见问题解析
23 November 2018
细胞成像的实验流程
固定
fixation
通透
permeabilization
23 November 2018
细胞成像的实验流程
样本封闭
固定
fixation
通透
permeabilization
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
23 November 2018
5. 细胞成像的应用：药物筛选模型
A screening approach. Screens can be carried out in cells by examining multiple protein markers and functional changes (for example, cell morphology) using automated high-content imaging.
23 November 2018
细胞成像的应用
细胞免疫荧光的应用
• 观察目标蛋白表达丰度
• 观察亚细胞定位 • 观察蛋白的共定位
Immunocytochemistry/ immunofluorescence
定性、定量 定位 定位
• 很好的药物筛选模型
定量
23 November 2018
1. 细胞成像的应用：观察目标蛋白表达丰度
23 November 2018
预吸附（Pre-adsorbed）的二抗
排除二抗与不同种属的一抗结合，减少非特异性结合，降低背景。
• •
Preadsorbed Alexa Fluor® 405 conjugated secondary antibodies Preadsorbed Alexa Fluor® 488 conjugated secondary antibodies
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
固定：有效维持细胞的形态，结构与组分。 使细胞被―保存‖和稳定在接近生理培养的状态。
Live cell imaging 活细胞成像不要固定细胞
细胞成像的实验流程
样本固定
固定方式的不同: case1. 细胞膜定位
DAPI ITAM
Tubulin
Merge
100% Methanol
4% PFA
23 November 2018
细胞成像的实验流程
样本固定
固定方式的不同: case2. 细胞膜定位
DAPI EGFR (phospho Y1068) Tubulin Merge
DMSO
DAPI CLU DAPI
DNP
CLU
MMP-9
merge
MMP-9
merge
Oncotarget, Vol. 7, No. 5
23 November 2018
2. 细胞成像的应用：观察目标蛋白的亚细胞定位
Stem Cells. 2012 October ; 30(10): 2065–2075. doi:10.1002/stem.1139.
• • • •
浓度梯度确定抗体的最佳工作浓度，使特异性染色最大化并减少背景 避免抗体反复冻融，降低抗体效价 室温孵育2小时或4℃孵育过夜 使用1%BSA in PBS 作为抗体稀释液
建议浓度
23 November 2018
细胞成像的实验流程
二抗孵育
固定
fixation
通透
permeabilization
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
通透化
1. 当抗体检测细胞内蛋白时（包括抗原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进行通透。
2. 将样品在含0.1-0.2% Triton X-100的PBS 中孵育10 分钟。 3. 使用预冷的丙酮固定则不需要通透。
封闭
blocking
复染和封片
counterstaining/ mounting
二抗孵育
Secondary Ab incubation
一抗孵育
Primary Ab incubation
23 November 2018
细胞成像的实验流程
样本固定
固定
fixation
通透
permeabilization
抗原
wk.baidu.com
二抗 标记物
一抗
样本
23 November 2018
荧光显微成像
ICC/IF 细胞免疫荧光
• 使用抗体对细胞中目标抗原进行定位、 定性或定量分析
Live cell imaging 活细胞成像
• 通过连续采集显微镜下的图像来研究 活细胞的结构与功能
23 November 2018
细胞成像的发展
•
• •
Preadsorbed Alexa Fluor® 555 conjugated secondary antibodies
Preadsorbed Alexa Fluor® 594 conjugated secondary antibodies Preadsorbed Alexa Fluor® 647 conjugated secondary antibodies Pre-adsorbed HRP conjugated secondary antibodies Pre-adsorbed biotinylated secondary antibodies
23 November 2018
3. 细胞成像的应用：观察细胞显微结构
STOM 超分辨显微镜
Ke Xu, Guisheng Zhong et at., 2013
23 November 2018
4. 细胞成像的应用：观察蛋白的共定位
Journal of virology, July 1998, p. 5717-5727
成像技术 荧光素
荧光显微镜
FITC/TRITC/PE
共聚焦显微镜
Cy2/Cy3/Cy5
超分辨率荧光 显微技术
Alexa Fluor® / DyLight®
Quantum Dot
Alexa Fluor® is a registered trademark of Molecular Probes, Inc, a Thermo Fisher Scientific Company.
细胞成像 Cell imaging
23 November 2018
细胞成像讲座内容
1. 细胞成像的原理和应用 2. 细胞成像的实验流程 3. 细胞成像的实验设计 4. 细胞成像的常见问题解析
23 November 2018
细胞成像的原理
通过巧妙结合免疫反应的特异性，实现在组织、细胞、亚细胞原位水平检测各种抗原物质。
Rabbit monoclonal
Mouse monoclonal
抗体的金标准
一致性
重组抗体： ~ 13000个产品结果
重组抗体 • 稳定持续供货 • 批间差异小 • 生产周期短
23 November 2018
抗体的金标准
一致性
IHC batch testing of human lung NSCLC stained with anti-PD-L1 (ab205921) at 2 µg/mL. A = control, B –F = different batches. All batches showed consistent results.
23 November 2018
细胞成像的实验流程
二抗选择
• • 一抗的种属来源：rabbit; mouse; chicken; rat 等 一抗的抗体亚型：IgG; IgM; IgA; IgY，IgE
ab150061
Donkey Anti - Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488) preadsorbed
封闭
blocking
一抗孵育
Primary Ab incubation
二抗孵育
Secondary Ab incubation
复染和封片
counterstaining/ mounting
• 二抗一般带有荧光素，注意避光保存
• 确定合适的浓度，避免无信号或背景过高 • 一般室温孵育半小时以上
• 多蛋白检测时，选择偶联不同荧光素的二抗，避免串色
一抗的种属
• Rabbit • IgG H&L
一抗的亚型
实验应用
• Alexa Fluor® 488 • Preadsorbed
Minimal cross-reactivity: Human, Mouse, Rat
是否需要预吸附
Alexa Fluor® is a registered trademark of Molecular Probes, Inc, a Thermo Fisher Scientific Company.