活细胞成像设备的选择

为活细胞研究设计光学显微系统时，首要考虑的是检测器的敏感度（对信号乃至噪音的检测），图像获取的速度，以及在此基础上标本的可行性。

对于固定细胞的成像，曝光时间及光强度相对来说都很高，这时可能会造成光漂白；然而对于活细胞成像，上述光的影响必须去除。

几乎在所有情况下，活细胞显微镜都会在尽可能高的图像质量与尽可能好的细胞活性之间取得一个平衡。

对于此类实验，时间及空间上的分辨率需要设定在能满足实验要求的水平上，而不是给予过度的光照或设定过多采样时间点。

基本上,一个理想的活细胞成像系统必需有足够的敏感度，来满足在弱荧光条件下仍能得到高图片质量；同时，系统也必需足够快，以记录整个动态过程。

另外，这个系统还需要有足够高的分辨率以捕捉样品细节，并且能够准确的实时测量每个微小的光强变化。

然而不幸的是，要改善上述的任意一条都需建立在牺牲其它性能的基础上。

因此现在还不能够设计出一个可以满足所有要求的活细胞成像体系。

研究人员现在只能在尽量减低不重要的信息的遗失的同时，尽可能的获得最优的重要参数。

这样，显微镜的配置最终取决于成像的要求，对于样品在实验期间活性的要求，进行标记的难度水平，以及仪器的可用性等实际因素。

如图一（Figure 1）所示为一台倒置研究级显微镜，它配有四个相机接口，并可满足对培养的组织的研究。

在四个接口上分别配有四个不同的相机，每一个都用来获取不同的图像。

在大多数情况下，这种显微镜的分光设计是100％进入相机或以80：20的比例同时分配给相机和目镜。

在弱光成像时，研究人员必需确保将最敏感的相机接在100％分光口上。

在图一中，彩色CCD（Full color CCD）接在显微镜的底部（a），它从物镜接受的光信号不经过棱镜或反光镜的反射。

这样的相机通常用来进行多色荧光或明场拍摄。

显微镜右侧连接高效的电子倍增电荷偶联设备（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用来检测极弱的荧光信号。

接在显微镜左侧的相机（c）配有一个高量子效应的感应器，可以感应700－1000nm 波长范围内的光，所以这个相机可以用来进行微分干涉相称（differential interference contrast，DIC）观察方法下厚标本的红外线照明成像。

最后，对于高分辨率的单色荧光成像，如全内反射荧光或其它荧光技术，图一中的显微镜在前部（d）配备了Peltier-cool 相机。

这个相机最小像素点为6μm，适合于此类成像的需求。

如图一中的配置非常昂贵，但是它能满足用户所有的成像要求。

进行活细胞成像的光学显微镜需要宽光谱增称模块。

大多数的研究者使用荧光显微镜，通常还会配合一种或多种透射光技术。

其中荧光技术包括了传统的宽视场落射荧光，激光扫描共聚焦，真空碟片共聚焦，场扫描共聚焦，多光子，全内反射（TIRF），荧光关联光谱，荧光寿命成像（FILM），光活化，镭射陷阱等技术。

相应的成像技术有光谱成像，多色成像，共定位，时间序列，荧光光漂白恢复，（FRAP，FLIP，FLAP），荧光共振能量转移（FRET），荧光散斑显微镜，膜片钳技术等，以上这些技术通常要配合一种或多种基础成像技术。

当荧光与明场,DIC,霍夫曼调制相称(HMC),相差等技术相结合时,荧光技术作为探针,可用于定位.对于绝大多数的活细胞成像来说,显微镜的配置都需要满足一些特定的需要以保证试验能够成功进行。

除了显微镜与数字成像系统，活细胞成像还需要考虑到两个限制因素——一个是保持细胞的活性，另一个是在北京噪音及自发荧光的基础上尽可能的提高信号强度。

提高活细胞成像的信噪比活细胞成像与固定细胞成像之间的基本区别是，后者的成像没有过多的限制，如合适视野的选定，曝光时间的设定，电子益增的设定，读出率及,偏移值等。

这样，染色的固定样品的成像就可以充分利用相机的全部动态设定。

因此，固定成像可以得到理想的信噪比。

但不幸的是，由于细胞活性对照明的严格要求，活细胞成像的情况又与固定细胞的成像有所不同。

在活细胞成像时，样品的灰度往往比背景高不了多少。

在这种情况下，成像首要考虑的是检测系统的暗电流及噪音值。

经济型的相机通常噪音都会比较高，导致背景混乱并掩盖样品信号，在读出速率增加时这种影响更为严重。

所以，几乎所有的活细胞成像设备质量的衡量标准都是检测器的好坏。

数字图像的噪音主要由四方面造成，检测器，照明系统，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的随机性造成），以及弥散光。

在大多数情况下，通过选择好的检测器或优化照明条件可以降低系统噪音。

事实上，任何一种光子检测器在记录的时候都会产生某种形式上的噪音。

扫描光聚焦及多光子显微镜中的光电倍增管（PMT）会产生杂电子。

同样的，用于明场，全内反射，针孔碟片共聚焦，场扫描显微镜的CCD也会生成背景暗电流。

对此，CCD 及光电倍增设备也做了一系列的改进，比如制冷设备，它会使仪器工作时保持在低温状态，从而降低暗电流的水平。

然而，在读取光信号并将模拟信号转换为数字信号的时候，特别是CCD这种仪器，也会产生噪音，即read noise，制冷数码相机产生的主要噪音。

Figure 2所示为影响活细胞成像质量的数字相机的读出速度与敏感度的相互依存关系。

The specimen is a culture of human 图中样品为人的宫颈癌细胞(HeLa 细胞系)，展示mKO （monomeric Kusabira Orange）荧光蛋白与人的α珠蛋白融合，图片在宽视场荧光下单色相机拍摄，照明中添加TRITC滤片，读出速度为10或1.25 MHz。

Figures 2(a) & 2(b)所示，在关闭CCD 光闸的条件下，低读出速度下的噪音要明显高于高读出速度下的噪音。

但是，如果将CCD 调节到全动态范围的话，这方面的影响就不明显了，如Figures 2(c) & 2(d) 所示；然而，在低光照条件下，低读出速度(Figure 2(f))的图片质量要明显的优于高读出速度（Figure 2（e）。

Figures 2(e) & 2(f) 的照明强度大约是 Figures 2(c) & 2(d) 的十分之一。

如将照明强度再降低5倍效果会更加明显，如Figures 2(g) & 2(h)，低读出速度下的图片至少还能够表达出需要的效果(Figure 2(h))，然而高读出速度下的成像质量则很不理想(Figure 2(g))。

一个成功的数字成像实验，要求样品的空间照明模式是连续的，即整个视野内的照明是连续一致的，每次成像间的图片也是连续一致的。

这取决于照明光源，使用钨卤素灯照明，样品的光学性质在显微镜下通常都是连续的（被称为光学一致性）。

然而使用激光扫描显微镜的照明装置对某一特定的点进行扫描，则每一次的扫描结果都不一样。

另外，使用汞灯（the mercury plasma arc-discharge lamp）作为宽视野荧光显微镜的照明光源，图片结果会在光谱上体现为特定的分离的波长峰值。

相比之下氙灯（Xenon lamps）在可见光谱下的结果就相当连续，÷但是在它在紫外区的结果不佳（这一光谱范围通常不用于活细胞成像）。

对于金属卤素灯这样的照明光源，它的特性介于汞灯与氙灯之间，也许是性能最佳的光源。

金属卤素灯能够提供从紫外到红外间连续的光谱，此外，保有汞灯的光强。

除了调整照明光源，为了达到照明一致的效果，还可以在灯箱及显微镜的照明输入端口之间添加一个光导纤维（或液体光导）。

在视场中的照明梯度可以通过计算来矫正（flat-field algorithms）。

灯泡有时在输出的亮度会与平均值有10％的偏离，这时需要注意的是它不能够通过光学纤维来矫正，而要使用稳定的电源。

对光子通量的测量是统计学的处理，在检测信号时会产生偏差。

所谓的Poisson 或 shot noise（如前所述），它体现在测量N个光子时，出现的偏差与N的平方根成正比，即信噪比。

所以，增加信号光子的数量N可直接提高信噪比及图像对比度。

提高信号最简单的方法是手机更多的光子，通常做法是增加曝光时间或提高激发照明的强度，但是这些做法会增加光毒性并降低细胞活性。

其次，另一个更有用的方法是加强检测器的敏感度。

为了解决活细胞成像低光照的问题，现在的数字CCD相机检测器更加敏感，这是通过面元划分（binning）来实现的(如Figures 3 & 8所示)。

一般CCD读取像素点会将横向上的像素值转移到只读寄存器上，然后进行顺序分析。

在binning 处理时，相互临近的一群光信号会被合在一起检测（2 x 2 或 4 x 4）为一个信号值进行输出。

这通过将多行像素转移到一系列只读寄存器(比如两行进行 2 x 2 binning ，四行进行4 x 4 binning)中然后多行同时读取来实现的。

在2 x 2 binning 情况下，空间分辨率会降低一半，信号强度增加4倍，信噪比增加2倍。

很明显，虽然降低了空间分辨率，但对于弱信号强度的提高是很显著的。

Figure 3显示的是将临近的像素结合在一起并不断的增加binning 水平，对数字图像的空间分辨率及最终尺寸的影响。

样品为印度麂鹿皮肤组织的纤维原细胞，它表达mCherry 荧光蛋白（红色伪彩）及人的β肌动蛋白，位于应力纤维组成的丝状细胞骨架网络中。

通常在进行荧光蛋白标记时，表现出很好的共定位的细胞常常表达很低水平的融合蛋白，其发出的信号极微弱。

如果不用binning处理(Figure 3(a))，在不产生光毒性及光漂白的曝光时间下得到的信号弱到无法辨别。

Binning 2 x 2 渐进到 4 x 4增加了信号水平，但降低了空间分辨率(Figures 3(b) and 3(c))。

在binning 8 x 8 像素下的图像(Figure 3(d))最亮。

但分辨率降低极多。

另外很重的一点是，在binning 处理时，增加合并像素点，图像尺寸按比例缩小例如，不进行binning 处理（1 x 1)的图像（Figure 3）的原始大小为1360 x 1024（pixels），在(2 x 2), (4 x 4), 及 (8 x 8) 处理条件下的图像分辨率分别为680 x 512, 340 x 256, 及 170x 128（pixels）。

如上所述，这些图像的尺寸被缩小了。

同样的，一个512 x 512 的数码相机在进行上述比例处理时，图像的大小将分别缩小为256 x 256, 128 x 128, and 64 x 64（pixels）。

Binning 处理的重点是读出噪音产生在binning 处理后，所以虽然读取了几个像素的集合，但是每个binning处理后的像素只读取一次。