IncuCyte：非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪 典奥生物

IncuCyte：非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪
典奥生物
目前，大部分的细胞检测方法采用的仍然是传统的终点法——仅仅给出最终结果，而且往往需要标记细胞和破坏细胞。

这种方法无法得到细胞在生长时的真正状态，也无法对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。

美国Essen公司开发了一款非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪——IncuCyte，用一种非侵入式的方法，记录细胞的实时生长状态。

IncuCyte是一套用于长时间动态，非伤害式的活细胞成像分析平台。

IncuCyte分为信号采集机和控制机两部分，信号采集机可放置于培养箱中，中间放置多种规格尺寸的板、皿、瓶及载玻片，在其下方有显微照相设备，通过显微拍照，对培养细胞进行连续的监测，并通过连接电脑和网络进行远程控制、数据读取与分析。

系统可自动集中每个时间点的图像并自动生成动态录像（live video）。

用户除了可以得到各种格式的图像或动态录像外，还可以得到由系统软件自动依据饱和度和计数分析生成的基于图像应用的图表，以显示细胞的变化及趋势。

IncuCyte FLR可采集相差图像和荧光图像，可显示GFP，YFP和荧光素等；IncuCyte EX可以与自动化的平板和液体处理系统整合。

它们都进行了光学组件的优化，成像清晰，无传统的光晕问题。

图１：培养箱中的IncuCyte
IncuCyte的优势：１）培养的细胞用相位差显微镜或荧光显微镜直接监测，为非破坏性的监测，细胞不用染色便可以观察监测，影像效果好；２）监测过程中细胞无需离开培养箱，不用担心培养条件的改变对细胞的影响；３）真正的长时间的动态活细胞成像，可达数天或数月，且没有传统显微系统的光晕问题，可以在384微孔板内监测细胞形态；４）图像处理软件自动依据饱和度和计数分析，量化细胞增殖；５）自动输出细胞生长曲线和细胞生长录像；６）通量大，可同时监测6块标准规格的细胞培养板/皿/瓶，细胞在384微孔板内实验，可以减少宝贵的药品消耗；７）支持超过200种的标准培养容器，无需特殊的培养容器，节约后期实验成本；８）可远程监控，进行数据读取和分析，无需反复出入细胞房，避免了潜在的污染隐患及人工出入观测之麻烦。

图２：IncuCyte内部结构，支持超过200种的标准培养容器
图３：IncuCyte记录的细胞的相差图像和增殖曲线
图３是IncuCyte记录的细胞增殖的相差图像和增殖曲线。

左侧图像是在同一视野内间隔12小时拍摄的CHO细胞的相差图像，图像可以24小时连续生成，而无需将细胞移出培养箱。

右侧的增殖曲线是依据间隔3小时的图像生成的，由软件自动将图像数据转换成定量的饱和度vs.时间的数据，生成动态的增殖曲线。

最后图像会被导出成单独的JPEG文件或视频。

IncuCyte软件功能：通过联网的软件，用户可以在任何一台联网的计算机上操控仪器，而无需反复拿进拿出标本及出入细胞房，这使IncuCyte成为了一个“虚拟的培养箱”。

用户可以在软件的操作界面上定义耗材的类型、拍摄的时间和位置。

IncuCyte可以自动对焦，自动进行图像收集。

对得到的图像也可以进行亮度、尺寸、对比度的显示控制。

用户可以电子化标记器皿，并设定关键词，必要时可用设定的关键词搜索数据库，方便查询过去任何时间得到的图像和数据。

用户还可以直接从软件中抓取图像、图表、曲线至Word、Excel、Powerpoint和Email中。

生成的所有数据均可存档，并且数据和图表可以打包封存，便于用户带回家分析。

图４：软件操作界面
IncuCyte的应用：
1）监测细胞增殖（Proliferation）
可监测细胞形态上的变化，可用荧光标定细胞核，观察细胞核的大小及计数。

关键特性：1）由实时图像获得定量的动态的过程指标；2）指标为非侵入型，如单层饱和度；3）标记指标（GFP或活细胞染色）可进行细胞核计数；4）所有动态信号均
有图像和影片验证。

图5：不同细胞的生长曲线，每隔3小时拍照，自动生成单层饱和度VS.时间图表
2）细胞质控（Cell Culture QC）
监测细胞形态上的变化，对细胞培养进行质控，如进行自动化的细胞培养，用175T 培养瓶，培养出大量且高质量的细胞，可做进一步细胞分析实验的细胞来源。

监测生长曲线与培养基的血清浓度的变化，寻找最适合的培养基的血清浓度。

监测生长曲线与培养基的配方的变化，寻找最适合的培养基配方。

关键特性：1）获得增殖细胞的实时图像，无需标记和将细胞移出培养箱；2）用动态指标，如单层饱和度优化培养过程；3）对微孔板能进行极好的质控，专利的HD（高清晰度）成像模式能消除微孔板的弯液面缺陷（meniscus artifacts）；4）用object algorithms评价细胞生长，消除人为干扰；5）系统可观察大面积的细胞培养容器，增加了评估的准确性；6）所有指标都有图像和影片进行验证。

图6：不同血清浓度培养基中CHO-hERG细胞的增殖曲线，单层饱和度VS.时间图表，细胞在2％血清的培养基中的生长快于在10% 血清的培养基中的生长
3）监测细胞毒性（Cytotoxicity）
关键特性：1）动态读数：可以实时动态地记录细胞活性在不同生理环境下的短期和长期的变化，不需要事先决定一个广泛适用的终点；2）Mix and read：将YOYO-1直接加入全培养基的细胞中，移除了液体的吸气步骤（fluid aspiration steps），消除了受损细胞的细胞破裂（cell disruption）；3）自动数据获取：可在培养箱中自动收集相差图像和荧光图像；4）细胞形态区分：高对比度的相差图像和影像资料可以使用户定性地区别Cytotoxic和Cytostatic（抗增殖）的不同作用；5）高度可重复性：实时动态的细胞死亡记录是高度可重复的，Z’在0.6和0.8之间。

图7：不同浓度的Taxol对MDA-MB-231细胞的毒理实验，Taxol在24小时和48小时处加入，每隔3小时拍照，自动生成单层饱和度VS.时间图表
4）监测细胞凋亡（Apoptosis）
关键特性：1）可动态、持续地观察凋亡的发生；2）独特的“免洗”标记程序使定量更方便，避免在标记过程中洗掉死亡的或将死的细胞；3）与流式细胞仪不同，细胞无需移动，就可进行分析，同样的细胞可以被用于后续的动态的研究；4）从实时图像中可取得动态的过程指标，包括细胞凋亡目标计数或细胞凋亡的目标区域的标准化；5）相差图像可用来监测与凋亡相关的细胞形态上的改变；6）实验结束后用染料染色计量DNA总数目，可得到凋亡指数（apoptotic index），表示凋亡对象的百分比；7）可用于96孔微孔板的定量分析。

图8：细胞凋亡的荧光图像
图10：伤口愈合、细胞迁移和细胞侵袭
IncuCyte可以从预设的时间点来获得图像并转换成影片。

系统记录了初始的Wound Ma
sk，然后随着Revised Wound Mask的生成，系统持续记录图像来跟踪伤口的愈合。

IncuCyte还可用于其它细胞运动如“迁移”和“侵袭”的监测。

用户可以很直观地通过2D的迁移和3D的侵袭图像来观察细胞形态的变化，并对两种细胞运动方式进行对比。

在我们的高清成像基础上，细胞无需标记就可以进行观察。

使用专利的算法，可以得到综合的基于时间推移的持续性图像采集指标，包括：伤口相对密度（专利）、伤口宽度、伤口饱和度，使实验结果的定量性
和重复性更好。

所有时间点的指标都可以通过细胞图像和影片进行验证。

细胞迁移的关键特征：1）无需标记；2）96孔的定量动态数据适合pathway analysis，能最优化动态范围，Z’>0.7；3）2D的迁移与ECM（细胞外基质）coating相容；3）可从实时图像中获得动态的过程指标，包括伤口相对密度（专利）、伤口宽度、伤口饱和度。

4）所有指标均有图像和影片验证。

细胞侵袭的关键特征：1）可重复的药理学：此实验使用户能评估在有细胞外基质（ECM）存在时，不同试剂对细胞的药理学作用；2）细胞形态学：可按事先制定的方式获得图像，使用户能观察到2D的迁移和3D的侵袭时细胞的不同的形态变化；3）对比：用户能在同一块微孔板上设置不同的ECM浓度，对比迁移和侵袭；4）无需标记：HD成像技术无需细胞标记；5）动态读数：用户能同时观察到不同实验变量下的侵袭的速度和程度，可用于探索基于时间的药理学、进行实验优化（如ECM浓度，细胞密度）、增加实验敏感性；6）可定量：当使用专利的伤口相对密度（RWD）指标时，结果是定量的，可重复的。

y
0.01uM
0.04uM
0.1uM
0.3uM
1uM
3uM
Vehicle
Time (hours)
R
W
D
%
图11：Cytochalasin D对HT 1080细胞的迁移的抑制作用，伤口相对密度（RWD%）VS.
时间图表，Cyto D浓度越大，伤口愈合越缓慢
图12：细胞迁移（奇数列）和细胞侵袭（偶数列）图表对比，伤口相对密度（RWD%）VS.
时间图表
7）监测血管新生（Angiogenesis）
血管新生是一种复杂、多步的过程，包括细胞增殖、迁移和血管形成。

IncuCyte FLR 和GFP-AngioKits合用，能监测血管生成的全过程，同时测定药物对血管生成的作用。

关键特性包括：1）使用人类的原生细胞，和共培养体系可显示血管新生过程中的所有阶段的变化；2）实验十分精确，Z’>0.7；3）动态读数可研究复杂的通路，包括VEGF（血管内皮生长因子）和non-VEGF（非血管内皮生长因子）信号介导的血管新生；4）时序性的读数可研究药物基于时间的作用，如对血管分裂的作用；5）能测量促血管生成
pro-angiogenic和抗血管生成anti-angiogenic的作用；6）定量指标来源于实时图像的采集，指标包括：血管长度、血管面积和分支点；7）所有数据可用图像和影片验证。

图13：血管新生，第1天和第14天对比，血管长度从0.6mm/mm2增长到11.6mm/mm2
图14：在VEGF存在的情况下Suramin对血管新生的抑制作用，Suramin浓度越大，血管长
度增长越小，抑制作用越明显。

8）监测报告基因（Reporter Gene）
与传统的终点荧光素酶方法对比，IncuCyte的关键特征在于：1）数据丰富：可获得终点法无法得到的多个时间点的实时动态的图像和数据；2）节约成本：无需裂解，无需荧光素酶法需要的终端反应底物，节省时间和花费；3）方便：动态的数据使用户能在单个的实
验中优化信号窗（signal window），无需事先决定何时终止实验；4）敏感：可得到每个条件下的多个时间点数据，增加了实验的定量性（quantitative robustness）；5）可定制：用户可根据需要定制启动子，修改反应体系，监测药物对报告基因的作用。

图15：rhTNF-α刺激诱导的HEK293细胞中，rhGFP报告基因表达的NF-κB的活性。

在用pNF-κB-rhGFP报告基因转染的HEK293细胞中，用3倍稀释的rhTNF-α处理。

图像以15min 为间隔获得。

对象饱和度（Object Confluence）表示报告基因的表达和/或启动子的活性
总结：
以上一些关键的重要的应用介绍，展示了IncuCyte 系统在定量的、非入侵性的、实时细胞分析上的作用。

非标记、非损伤性的成像技术以及数据分析可以让用户获得高质量的图像、录像和数据。

与其他利用电子阻抗监测细胞不同，IncuCyte可以记录细胞形态，得到图像和动态的录像。

更多信息，请参考Essen网站：和典奥生物网站：。