细胞免疫组化步骤

细胞免疫组化步骤

(2010-06-19 21:40:50)

细胞免疫组化（SABC法）步步看：

细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！

实验准备：

实验用品：

移液枪：1ml、200ul、10ul

枪头：1ml、200ul、10ul

枪头盒：1ml、200ul、10ul

EP管：1.5ml

湿盒

需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。

试剂：

细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒

操作步骤：

一、细胞爬片的制作

1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml

2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠

3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右

4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。

二、组化前处理

1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）

2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；

3、PBS漂洗，3x2min；

4、0.5%Txiton X-100 处理（室温）20min；

5、PBS漂洗，3x2min；

6、3%H2O2处理（室温）15min；

7、PBS漂洗，3x2min；

三、组化

1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；

2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h 或4°C过夜；

3、PBS漂洗，3x2min；

4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；

5、PBS漂洗，3x2min；

6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；

7、PBS漂洗，3x4min；

8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。一般在2-10min

9、自来水冲洗；

10、苏木素复染，15-30s；

11、自来水冲洗；

12、封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），镜下观察

若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：

70%（1次，1min）-80%（1次，1min）-95%（1次，1min）-无水乙醇（2x3min）-二甲苯（2x1min），观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。可重新进行！

得到结果：实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色；阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色！在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用！

在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂的用量和提高试剂的有效性。