微生物检验与临床课件

纸片法药敏试验
（一）试验材料：
2.药敏纸片：－10℃以下加干燥剂保存，取一瓶置4℃冰
箱备用。用前移至室温，10min后才可开瓶。 3. 0.5麦氏标准比浊管：将0.5mL0.048mol/L的BaCl2 （1.175% w/v BaCl 2·2H2O）加入到99.5 mL0.18 mol/L的H2SO4（1% w/v）中并不断搅动以维持混悬状 态。当光径为1cm时，0.5麦氏标准在625nm处的吸光 度值应为0.08~0.10。按每管4-6mL将硫酸钡悬液分 装于带旋盖的管子中，试管的大小应与稀释接种菌 所用的试管一致，标准浊度管应密封并贮存于室温 暗处。在使用前，应将浊度标准管充分混匀，目测 其外观浊度应均匀一致，若有大颗粒出现应更换此 标准管。每6个月应更换标准浊度管，或对其浓度进 行核实。
纸片法药敏试验 （二）试验方法：
1.菌悬液制备：
（2）对于苛养菌（如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌 和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球 菌推荐从孵育18~24h的非选择性培养基（如血 琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或 盐水制成悬液作为接种物，然后按上述方法将 浊度调整至0.5麦氏标准。需要注意的是当用 此法测试甲氧苄啶/磺胺甲恶唑时，来自血琼 脂培养基的菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺 胺拮抗物，细菌可在抑菌圈内部沿着敏感菌株 的周围产生模糊生长。
3.药敏试验的指征
临床分离株不需进行药敏的情况： � 某种菌株对某抗菌药从不耐药时，如A、 B群链球菌对青霉素； � 分离于正常寄生部位的条件致病菌和非 致病菌； � 标本内分离出多种细菌（混合生长） ， 它们与感染的关系很小或不明时。
3.药敏试验的指征
临床分离株必须进行药敏的情况： � 不能从感染菌的种属特征推测其药敏情况时 （如：金葡、GN等）； � 根据分离株的种属特征虽能推测其对某药敏 感，但患者对该药过敏； � 临床抗感染治疗中，早期奏效而后期出现耐药 表现时，虽分离出与早期相同菌株亦要再做药 敏（如：肠杆菌、枸酸、沙雷等）
现代微生物检验 与临床
为什么已经十天了，还不给我最终报告？ 为何病人一直在发烧，白细胞升高，血培养却是阴性？ 为什么那么多脓液，报告却是未见致病菌生长？ 为何脑脊液生化显示炎症状态，培养结果却是阴性？ 为什么病人治疗状态良好，实验室回报的却是泛耐药不动 杆菌？ 为什么药敏的结果与临床实际效果南辕北辙？
专题 一、 专题一、 标本的采集、运输和储存
“ 正确的微生物学检验始自正确的 标本采取。临床医师、护师及检 验技师都必须通晓其要领。”
著名的临床微生物检验专著Manual of Clinical Microbiology 的主编Patrick Murray
基本原则
1. 2. 3.
发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查。 尽量在抗菌药物使用前采集标本。 标本采集时应严格执行无菌操作，减少或避免机 体正常菌群及其他杂菌污染。 标本采集后应立即送至实验室。 盛标本容器须经灭菌处理，但不得使用消毒剂。 送检标本应注明来源和检验目的，使实验室能正 确选用相应的培养基和适宜的培养环境。
（4）皮肤消毒程序严格执行以下三步法：70%酒精 擦拭静脉穿刺部位待30s 以上；10%碘伏作用90s 以上，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径 3cm以上；70%酒精脱碘。待酒精挥发干燥后采血。 （5）培养瓶消毒程序：70%酒精擦拭血培养瓶橡皮 塞,作用60s；用无菌棉签清除橡皮塞子表面残余酒 精。
4. 5. 6.
（一）标本的选择
在采集标本之前，必须对标本和标本的 采集部位进行选择，以能够反映活动的 病程为标准。如果对标本没有进行选 择，或从有长居菌群的部位采集标本， 即使是执行了严谨的标本采集方法也不 能够提供什么有临床价值的资料。
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1. 临床价值不大的标本及替代方法和建议
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4.药敏试验的方法及其选用
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浓度梯度纸条法（Etest）：亦是测 定MIC的方法，本法融合了纸片法 和稀释法的优点，操作简单，可获 定量结果。对于慢生长菌也可应用。 缺点是成本较高。
5.药敏试验的操作步骤
纸片法药敏试验 （一）试验材料： 1、M-H琼脂：
将所购培养基按照Biblioteka 品的说明加适量水，经高压灭 菌后水浴冷却至45-50 ℃，倒入水平的无菌平皿中，使 其厚度为4mm。 每批MH琼脂制备完成后应检测其pH 值。凝固后的琼脂培养基在室温下的pH应为7.2~7.4。 新制备的琼脂平板可当天使用或密封于塑料袋中， 保存于2℃~8℃，一周内用完，使用前如琼脂表面过分 潮湿，应放于孵箱（35 ℃）或在室温下敞开盖子倒置 于层流罩中，直到多余的水分蒸发（通常10~30min）。
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（二）标本的采集
即使标本选择得再好，如果采集不 当也不能分离到病原菌，结果甚至 会被污染菌所干扰。
1. 标本最佳采集时机
（1）在感染发生的早期或急性期采样； （2）最好在用抗菌药治疗之前进行采样； （3）如果已经使用抗菌药物，应停药 1~2次再 进行采样，若病情不允许停药应在下次给药 前进行采样（此时药物浓度最低）。 （4）尿标本的采集应要求患者憋尿 6h以上； （5）痰标本查结核杆菌，以晨痰为佳；
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3. 标本最少采集量
（1）固体标本不应少于2g； （2）SCF不应少于1ml； （3）查真菌和结核菌的液体标本不应少于10ml； （4）拭子标本应同时取两份，分别用于培养和涂片。 （5）血液标本，成年人采血量为8~10ml, 新生儿与 婴幼儿为1~2ml，儿童采集3~4ml 。每增加1ml血 量平均提高阳性率3.2%。
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如果标本的处理有所延迟，应将标本放入 转运培养基中在适当条件下进行短期储存。 浅表或开放性标本可选用需氧转运培养 基，封闭或深部标本应选用厌氧转运培养 基。 怀疑对温度敏感的病原菌感染的标本应在 室温下保存，其他标本均可放在4℃下进 行保存。
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专题二、 细菌的耐药性与抗生素的 合理应用
一、细菌耐药性的发展 二、微生物室标准化药敏试验中抗生素 的选择 三、如何解读微生物报告
药物敏感 性试验 药物敏感性试验
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目前，我国卫生部要求所有的微生物室 必须开展鉴定、药敏、耐药性报告。药 敏试验以美国国家实验室标准化委员会 NCCLS)的规则为规则 (CLSI/ CLSI/NCCLS)
2.药敏试验的目的
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指导医生选择最佳药物治疗细菌感染； 了解和预测当地致病菌的耐药性变迁， 寻找相应的对策； 根据细菌耐药特征进行细菌鉴定； 根据流行株的耐药谱分析，为流行病学 和医院内感染的调查和控制提供依据； 评价新抗菌药的临床价值。
纸片法药敏试验 （二）试验方法：
1.菌悬液制备：
（ 1 ）从琼脂平板上选取至少 3~5 个形态特征一致的菌 落，用接种环接触每个菌落顶部后将细菌转移到含4~5 ml适宜的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，将 此肉汤培养物置35℃孵育至其浊度等于或超过0.5号麦 氏标准（通常需 2~6h ）。用无菌盐水或肉汤将旺盛生 长的菌液的浊度调整到相当于0.5麦氏标准，此时对质 控菌株 ATCC 25922 来说，细菌数约为 1~2 × 108 CFU/ ml。可使用光度计比色（比浊），也可在光线充足的 地方，对着有白色背景与黑色线条的卡片，将接种管 与0.5麦氏标准管进行目测比浊。
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即使是同一种细菌感染的不同阶段，标本的采集 部位也应随之改变。如，脑膜炎奈瑟菌的感染分 为上呼吸道感染期、菌血症期、皮疹期和脑膜炎 期。 发热患者通常采血部位为肘静脉。切忌在静滴抗 菌药物的静脉处采取血标本。多次采血时 , 应在不 同部位进行。不要从血管插管内采血。 脓肿标本应尽可能靠近脓腔底部或脓腔壁采样。
（6）血标本的采集 血标本的采集应在寒战后即刻采样，无寒 战患者应在发热的不同阶段进行采样。
①急性感染患者: 10min内从不同部位（两臂）分别采2~3套血样。 ②感染性心内膜炎患者: 24h内从不同部位采血3套, 每次间隔不少于30分 钟。 ③若24h内为阴性，可再采血2~3套。
2. 标本采集的最佳部位
4.药敏试验的方法及其选用
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纸片扩散法（K-B法）：操作简单，适合 在不同时间里进行个别菌的试验，将细 菌的反应分为敏感、中介、耐药三部 分，结果直观，基本上能满足临床需要。 但无定量结果，对于慢生长菌（包括厌 氧菌、真菌）和扩散慢的药物不适用。
4.药敏试验的方法及其选用
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稀释法：产生定量结果（报告MIC）,不 受菌株生长速度和药物扩散速度的影响。 但较复杂，结果需有经验的医师解释。 在纸片法不适用或结果模棱两可时，以 及需要确切了解敏感计量和控制使用计 量时，可采用稀释法。 稀释法有试管肉汤稀释法和微量稀 释法两种。
标本类型 替代方法或建议 ———————————————————————————— 烧伤、伤口（拭子） 组织或抽吸物 褥疮（拭子） 组织或抽吸物 坏疽损伤（拭子） 组织或抽吸物 牙周损伤（拭子） 组织或抽吸物 直肠周围脓肿（拭子） 组织或抽吸物 静脉曲张性溃疡（拭子） 组织或抽吸物 结肠造口术排出物 不处理 不处理 Foley导管头 新生儿胃抽吸物 不处理 恶露 不处理 呕吐物 不处理
纸片法药敏试验 （二）试验方法：
2. 接种 应在接种物制备后 15min 内接种 MH 琼脂平板。用无菌棉拭蘸 取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然 后在琼脂表面均匀涂布, 每涂布一次后，将平板旋转 60度再涂 布，共涂布3次，以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘 涂抹一周。 3.贴药敏纸片 接种好的平板可敞开盖子倒置在室温下干燥 3~5min，在 15min之内用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻 压，使纸片与琼脂表面完全接触。各纸片中心相距应大于 24mm，通常150 mm平板至多贴12个纸片，90~100 mm平板至 多贴6~7个纸片。在纸片贴于琼脂平板后药物可能立即扩散， 故一旦纸片贴上后就不能再移动，若要重新放置，可用一个 新的纸片贴在平板的另一位置。
细菌耐药的现状
40年代 纯化获得青霉素 几十年来抗生素 的进一步开发 各种β-内酰胺类抗生素 广泛应用于临床 对抗耐药的新药的不 断研制开发 细菌优胜劣汰，耐药菌 队伍不断壮大 VRE AmpC 真菌或机会菌 60年代研制成 第一代头孢菌素
MRSA ESBLs
特别是三代头孢的广泛 应用，针对各种抗生素 的耐药菌显著增多
纸片法药敏试验 （二）试验方法：
4.孵育
纸片贴好后，15min内（若超过15min,纸片 中的抗菌药物提早扩散而菌生长滞后 )将平板 倒置放入35℃孵箱（苛养菌药敏平板应放置于 5％CO2环境中）16~18h后读取结果，葡萄球菌 和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万 古霉素的耐药性。
非发酵菌碳青霉烯类耐药 是人类抗感染的恶梦! ! !
产KPC酶的菌株在欧洲广泛流行
超级细菌（ Superbugs ） （是指对其有效治疗药物几乎均耐药的细菌）
一、细菌耐药性的发展 二、微生物室标准化药敏试验 三、如何解读微生物报告
1.什么是细菌药物敏感试验
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细菌药物敏感试验又称细菌对抗菌 药物的敏感试验，简称药敏，是指 在体外测定抗菌药物抑制或杀死细 菌的能力，亦即是测定细菌对药物 的敏感性或耐药性。
（四）标本的转运
1. 所有标本必须立刻送交实验室，最好 2h以内。 对环境敏感的微生物要求床边接种，包括厌 氧菌、淋球菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜血杆菌等。 2. 所有标本必须放入有分隔空间的防漏塑料袋 内转运。严格按照生物安全要求进行操作。 3. 如标本的运送有所延迟，应将标本放入运送 培养基中送检。
（五）标本的储存
4. 防污染措施
（1）自然咳痰法：留取前刷牙，清水漱口 3次，用力 咳出呼吸道深部的痰吐至无菌广口瓶内，盖好盖子。 （2）清洁中段尿采集法： ①女性：采样前应先用肥 皂和水清洗外阴部及尿道口，弃去前段尿，留取中 段尿于灭菌试管内，盖好塞子立即送检。 ②男性： 用肥皂和水翻转包皮清洗阴茎头，弃去前段尿，留 取中段尿于灭菌试管内，盖好塞子立即送检。 （3）烧伤、褥疮和伤口应该用无菌盐水擦拭表面后， 采集损伤底部。