噬菌体表面展示技术

6.DNA结合蛋白： 锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物， 这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白 区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌 体展示技术也可以用于创造一个大的、具有 识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用 这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小 鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒 的基因，或干扰病毒感染生活周期。
其中丝状噬菌体展示PⅢ系统单价展示，可以 筛选高亲和力配体，PⅧ系统拷贝数高，利于疫苗 的研制，但丝状噬菌体分泌释放，不易展示大分子 蛋白； λ噬菌体展示和T4噬菌体展示系统容量大， 拷贝数高，但不易筛选高亲和配体；T7展示系统可 以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是 目前最为理想的展示系统。
目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅 速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用 位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗 体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研 究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的 不同领域得到了应用，并对这些领域产生了 深远的影响。
噬菌体展示技术的优势
• 噬菌体展示技术最关键的优势有： • 第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能； • 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的 情况下，通过感染细菌得到富集； • 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬 菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽 或蛋白质的序列分析既快速又简便。
7.蛋白质组学： 噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质 合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其 有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文 库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是 利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万 种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术 正好能符有关的蛋白质。
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• 基本原理 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因， 形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表 面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独 立的空间结构和生物学活性。
利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲 和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤）多 肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码 基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌 体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现 型）和编码基因（基因型）之间完美地结合 起来，为生物科学提供高效而实用的研究手 段。
五、噬菌体展示技术的应用现状
1. 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统 的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够 在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬 菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技 术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗 体提供简便而高效的操作系统 。
2. 疫苗：
与传统的质粒DNA疫苗相比,利 用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具 有独特的优势：噬菌体传递的DNA 疫苗 诱生的抗体应答持续时间更长, 滴度更高； 噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫 佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性 方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直 接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA 疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫 效果。
表型————基因型 展示肽————编码基因
二、发展简史
Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插 入丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合 展示。
Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
• 1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 • Smith GP. Science.1985; 228:1315-7
• Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37
三、噬菌体展示的基本原理
四、噬菌体表面展示的步骤
• 不同基因分别被插入噬 菌体基因组中 • 分离纯化的噬菌体只是 展示一个蛋白，多肽或 者与靶蛋白相互作 用的噬菌体
目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统有 丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌 体展示系统和T7噬菌体展示系统。
一、定义
将 外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在 病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA则位于 病毒粒子内。 使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联 系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘 选得以快速鉴定。
噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT)是一项筛选技术，
• • • • • • • • 1988 噬菌质粒系统 1990 two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection
3. 多肽类药物：
如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴 定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 αbungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多 肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合 或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一 种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去 淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环 状8肽能与血管促生素结合，并息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体， 如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与 受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细 胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。 在不知道任何有关的受体和配体信息的情况 下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特 异与靶组织结合的多肽和蛋白。
4. 肿瘤药物导癌药物的定向输送工具 。一个成功的 实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具 有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取 出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下 来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的 特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物 具有更强的抑制肿瘤的效果.
噬菌体展示技术的局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的 展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容9。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些 蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛容易被降解，因此，必须差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是 因为它们的蛋白质合成示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些 对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。