抗体噬菌体展示技术ppt课件
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噬菌体展示技术和其应用ppt课件
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应用举例：
部分做过的工作
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
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34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
噬菌体展示技术及其应用.ppt
噬菌体展示的基本原理
在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源 基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒 蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可 保持分子，采用适当的淘洗方法（亲 和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤）多 肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码 基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌 体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现 型）和编码基因（基因型）之间完美地结合 起来，为生物科学提供高效而实用的研究手 段。
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝 状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面, 建立了噬菌体展示随机肽库。
Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands wit h an epitope library. Science , 1990 ,249 :386.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。
Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface . Science ,1985 ,228 :1315 - 1317.
Lytic phages specifically kill pathogenic bacteria as an alternative to antibiotics
Example of a successful phage therapy treatment.
接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病 毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染 病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清 α肿瘤坏死因子(TNF-α) 水平, 体外加入 噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和 白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。 总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和 体液免疫的天然佐剂。
噬菌体展示技术的原理及应用ppt课件
完整版ppt课件
32
5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等
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33
6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
完整版ppt课件
34
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，
如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与
2
噬菌体展示技术是将
各种多肽或蛋白质以融合
蛋白的形式表达并展示在
噬菌体表面，同时将其遗
传密码包含于噬菌体内部，
这使得蛋白质的功能与其
基因密码有机的连结在一
起。
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3
选择方法： 淘选（Panning)
而不是 筛选（Screening)
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4
非展示系统
展示系统
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应用前景:
单克隆抗体 杂交瘤技术
杂交瘤 ~103 几个月 繁杂
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简
必须
高 有限 再克隆
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有限
可避免
+ 低 无限 直接
28
不可估
二、噬菌体展示技术的应用现状
1. 抗体：
2.
抗狂犬病毒的单链抗体，
抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，
此抗体可专一性杀死被HIV-1感染
完整版ppt课件
13
•
•
• 毒）
• 表面展示系统 • • •
噬菌体展示技术PPT精选文档
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介课件PPT
3.6 单链丝状噬菌体展示系统
丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性细菌的病毒大家族， 他们都含有单链DNA基因组，都包装于由含有几千拷贝的主 要衣壳蛋白（PⅧ）和位于顶端的次要衣壳蛋白（PⅢ）所组 成的少许柔韧性的管状衣壳中。M13和Fd噬菌体均是丝状噬 菌体。
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3.6.1 M13噬菌体的组成和结构
（2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。
当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺
少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载
体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。该系统有一
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3.5 T4噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的 一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质 完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上 的外壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直 接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要 复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性 和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分 2021/泌3/10 途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少 15
Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
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1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection
噬菌体展示技术的原理及应用知识讲解45页PPT
噬菌体展示技术原理及应用知识讲 解
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
《噬菌体展示技术》课件
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体作为载体，展示蛋白质和肽段的技术。本 课件将介绍噬菌体展示技术的基本原理和应用领域。
简介
什么是噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一项利用噬菌体将蛋白质或肽段展示在其表面的技术。
为什么要用噬菌体展示技术
噬菌体展示技术可以很好地展示和筛选特定的蛋白质或肽段，具有高效和可控性。
噬菌体展示技术的应用领域
噬菌体展示技术在抗体选择、疫苗研发和肿瘤治疗等领域具有广泛应用。
基本原理
1
噬菌体结构简介
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，具有
基因工程技术
2
包裹着基因组的蛋白质壳和尾部结构。
通过基因工程技术将目标蛋白质或肽段
的编码序列与噬菌体基因组融合。
3
噬菌体展示技术基本流程
包括载体构建、噬菌体感染宿主细菌、 蛋白质或肽段展示、筛选和验证等步骤。
噬菌体展示技术的未来发展前景
随着技术的不断进步，噬菌体展示技术在生物医药领域有望取得更大的突破。
未来，噬菌体展示技术有望在药物研发、生物制药和生物能源等领域发挥更重要的作用。
2 噬菌体展示技术的研究热点
当前的研究热点包括展示技术的改进、筛选方法的优化和多肽库的构建。
总结
噬菌体展示技术的优点
具有高效、可控、快速筛选和改造特定蛋白质或肽段的优点。
噬菌体展示技术的局限性
依赖于噬菌体感染宿主细体选择技术
噬菌体展示技术可用于快速筛选和改造具有高亲和力的抗体，用于治疗各种疾病。
疫苗研发技术
利用噬菌体展示技术可以快速筛选出具有高效免疫特性的抗原，用于疫苗的设计和开发。
肿瘤治疗技术
噬菌体展示技术可以实现肿瘤靶向治疗，将药物或治疗性蛋白质展示在噬菌体表面，以增强 治疗效果。
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体作为载体，展示蛋白质和肽段的技术。本 课件将介绍噬菌体展示技术的基本原理和应用领域。
简介
什么是噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一项利用噬菌体将蛋白质或肽段展示在其表面的技术。
为什么要用噬菌体展示技术
噬菌体展示技术可以很好地展示和筛选特定的蛋白质或肽段，具有高效和可控性。
噬菌体展示技术的应用领域
噬菌体展示技术在抗体选择、疫苗研发和肿瘤治疗等领域具有广泛应用。
基本原理
1
噬菌体结构简介
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，具有
基因工程技术
2
包裹着基因组的蛋白质壳和尾部结构。
通过基因工程技术将目标蛋白质或肽段
的编码序列与噬菌体基因组融合。
3
噬菌体展示技术基本流程
包括载体构建、噬菌体感染宿主细菌、 蛋白质或肽段展示、筛选和验证等步骤。
噬菌体展示技术的未来发展前景
随着技术的不断进步，噬菌体展示技术在生物医药领域有望取得更大的突破。
未来，噬菌体展示技术有望在药物研发、生物制药和生物能源等领域发挥更重要的作用。
2 噬菌体展示技术的研究热点
当前的研究热点包括展示技术的改进、筛选方法的优化和多肽库的构建。
总结
噬菌体展示技术的优点
具有高效、可控、快速筛选和改造特定蛋白质或肽段的优点。
噬菌体展示技术的局限性
依赖于噬菌体感染宿主细体选择技术
噬菌体展示技术可用于快速筛选和改造具有高亲和力的抗体，用于治疗各种疾病。
疫苗研发技术
利用噬菌体展示技术可以快速筛选出具有高效免疫特性的抗原，用于疫苗的设计和开发。
肿瘤治疗技术
噬菌体展示技术可以实现肿瘤靶向治疗，将药物或治疗性蛋白质展示在噬菌体表面，以增强 治疗效果。
抗体噬菌体展示技术(课堂PPT)
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
Phage display 噬菌体展示技术ppt课件
Phage display 噬菌体展示 技术
Introduction
• Invented by George P. Smith in 1985. • A method for the study of – protein–protein, protein–peptide, and protein-DNA interactions
Applications
• Determination of interaction partners of a protein. • Determine tumour antigens (for use in diagnosis and therapeutic targeting). • Searching for protein–DNA interactions using specially-constructed DNA libraries with randomised segments. • In vitro protein evolution (also called protein engineering). • Drug discovery. • Finding new ligands (enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists) to target proteins.
Life Cycle of M13
M13 pIII & pVIII Coat-Protein System
• pIII minor Coat-Protein – Consist of 406 aa, 5 copies per phage. – Located at the tail of the phage. – Can display 300aa protein. • pVIII major Coat-Protein – 2700 copies per phage, 10% can used for display. – ~200 copies of fusion proteins per phage. – Proteins are usually small. – High affinity abilities because of high copy numbers.
Introduction
• Invented by George P. Smith in 1985. • A method for the study of – protein–protein, protein–peptide, and protein-DNA interactions
Applications
• Determination of interaction partners of a protein. • Determine tumour antigens (for use in diagnosis and therapeutic targeting). • Searching for protein–DNA interactions using specially-constructed DNA libraries with randomised segments. • In vitro protein evolution (also called protein engineering). • Drug discovery. • Finding new ligands (enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists) to target proteins.
Life Cycle of M13
M13 pIII & pVIII Coat-Protein System
• pIII minor Coat-Protein – Consist of 406 aa, 5 copies per phage. – Located at the tail of the phage. – Can display 300aa protein. • pVIII major Coat-Protein – 2700 copies per phage, 10% can used for display. – ~200 copies of fusion proteins per phage. – Proteins are usually small. – High affinity abilities because of high copy numbers.
噬菌体表面展示及其应用ppt实用资料
噬菌体表面展示及其应用
扬州大学 生物科学与技术学院
噬菌体展示技术原理
• 噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效 的筛选技术,即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆 到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合 表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白 或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内， 因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。 基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、 酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技 术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物 开发的强有力工具。
coated with 不同基因分别被插入噬菌体基因组中Different sets of
洗脱结合的噬菌体
Amplify eluted phage
Repeat selection
Analyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
2. Journal Of Virology 2001 pp. 75 3. Nature 2000 pp. 45
操作:
繁杂
相对简单
2004 Garland Publishing; pp-150-151 无论靶蛋白是抗原，蛋白或者病原，都可以快速有效地处理并用于筛选
steptavidin and
2004 Garland Publishing; pp-150-151
Antibody IgG structure
Fab
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
去除未结合的噬菌体病毒粒子.
coated microtitre wells
扬州大学 生物科学与技术学院
噬菌体展示技术原理
• 噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效 的筛选技术,即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆 到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合 表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白 或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内， 因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。 基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、 酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技 术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物 开发的强有力工具。
coated with 不同基因分别被插入噬菌体基因组中Different sets of
洗脱结合的噬菌体
Amplify eluted phage
Repeat selection
Analyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
2. Journal Of Virology 2001 pp. 75 3. Nature 2000 pp. 45
操作:
繁杂
相对简单
2004 Garland Publishing; pp-150-151 无论靶蛋白是抗原，蛋白或者病原，都可以快速有效地处理并用于筛选
steptavidin and
2004 Garland Publishing; pp-150-151
Antibody IgG structure
Fab
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
去除未结合的噬菌体病毒粒子.
coated microtitre wells
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▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
DNA recombination and gene manipulation; multiple cloning sites (MCS)
▪ Coat protein: PIII (larger protein, less than 5 copies,)
PVIII (more than 5 copies, decreased length)
Introduction of Phage Display Technology
The Ff bacteriophage structure
Introduction of Phage Display Technology
The scheme of phagemid vector
▪ IG region: intergenic region, usually contains the
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for Recombinant Antibody Selection
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
Contents
• Introduction of Ab phage Display Technology
• Ab Formats for Phage Display
• Ab Libraries Construction
• Producing the combinatorial library (ideally with 108 to 109 members) of
Antibody Formats
• The most commonly used format: single-chain variable fragment (scFv)
• More efficiently than through conventional hybridoma system.
• Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria, rather than mammalian cell line.
✓Simplicity of cloning process
✓Fast and easy library generation
✓A high display rate (small protein size ~25 kDa)
✓Less stable than Fab fragments
✓Tend to form dimers (can be reduced with linker more than 20 amino acids)
• Phage Ab Selection Methods & Strategies
• Phage Ab Screening Applications
• In vitro Affinity Maturation
• Expression & Purification of Phage Ab Fragments
Antibody Formats
• Fab
✓The light chain (VL-CL) and the Fddomain (VH-CH1) of the heavy chain of an antibody.
✓During bacterial expression, these two chains are synthesized separately, and secreted into the periplasm where they fold to form heterodimers.
often used for phage display, primarily the M13 and Fd strains.
▪ Proteins to be selected are infused to all
five coat proteins, with pIII and pVIII most commonly used.
packing sequence and replication origin of minus and plus strands
▪ Molecular tag: to facilitate library screening and for
protein analysis
▪ Restriction enul for
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
• Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant antibody production.
• Bypass immunization in antibody selection.
• Bypass the use of animal cells for production of antibodies.
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
DNA recombination and gene manipulation; multiple cloning sites (MCS)
▪ Coat protein: PIII (larger protein, less than 5 copies,)
PVIII (more than 5 copies, decreased length)
Introduction of Phage Display Technology
The Ff bacteriophage structure
Introduction of Phage Display Technology
The scheme of phagemid vector
▪ IG region: intergenic region, usually contains the
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for Recombinant Antibody Selection
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
Contents
• Introduction of Ab phage Display Technology
• Ab Formats for Phage Display
• Ab Libraries Construction
• Producing the combinatorial library (ideally with 108 to 109 members) of
Antibody Formats
• The most commonly used format: single-chain variable fragment (scFv)
• More efficiently than through conventional hybridoma system.
• Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria, rather than mammalian cell line.
✓Simplicity of cloning process
✓Fast and easy library generation
✓A high display rate (small protein size ~25 kDa)
✓Less stable than Fab fragments
✓Tend to form dimers (can be reduced with linker more than 20 amino acids)
• Phage Ab Selection Methods & Strategies
• Phage Ab Screening Applications
• In vitro Affinity Maturation
• Expression & Purification of Phage Ab Fragments
Antibody Formats
• Fab
✓The light chain (VL-CL) and the Fddomain (VH-CH1) of the heavy chain of an antibody.
✓During bacterial expression, these two chains are synthesized separately, and secreted into the periplasm where they fold to form heterodimers.
often used for phage display, primarily the M13 and Fd strains.
▪ Proteins to be selected are infused to all
five coat proteins, with pIII and pVIII most commonly used.
packing sequence and replication origin of minus and plus strands
▪ Molecular tag: to facilitate library screening and for
protein analysis
▪ Restriction enul for
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
• Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant antibody production.
• Bypass immunization in antibody selection.
• Bypass the use of animal cells for production of antibodies.