毕赤酵母从入门到提高

螺旋讲堂2010年第1期 总第20期

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毕赤酵母表达从入门到提高

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写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可

以让大家理解一些不常见的符号及意义。下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL

一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.主要优点

1)

具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)

作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)

营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)

可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)

表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)

在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。P . pastoris 表达的糖蛋白的糖链长度为

8-14个甘露糖，而S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达50-150个；S. cerevisiae 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有

终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。

2. 毕赤酵母常用的菌株类型

2.1Mut+和Mut s

在毕赤酵母基因组中有2个醇氧化物酶编码基因，即AOX1基因和AOX2基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1基因表达的AOX1蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2酶蛋白，这就是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Mut s产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1基因，也有AOX2基因时，菌株的表型为Mut+该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2基因时，菌株的表型为Mut s，该菌株在有甲醇的培养基中生长缓慢。

2.2 菌株GS115、KM71和SMD1168的区别

GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。GS115、KM71、SMD1168 是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115 表型为Mut+。重组表达载体转化GS115 后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Mut s，可以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和GS115 类似，但SMD1168 是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71 没有AOX1 基因，本身就是Mut s。因此转化后所有的转化子都是Mut s，不必鉴定表型。

3. 毕赤酵母菌株的生长

毕赤酵母适宜的生长温度是28至30度，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。关于毕赤酵母的生长速度:

在YPD培养基中，不论是Mut+还是Mut s其在对数期增殖一倍的时间大约为2h

Mut+和Mut s菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的

存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时

存在甲醇的情况下，Mut s在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时

二、 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式

通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的1-10%。

1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点

GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插

入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Mut s表型。