毕赤酵母从入门到提高

螺旋讲堂2010年第1期 总第20期
w w w .h e l i x n e t .c n 生物人的网上家园
毕赤酵母表达从入门到提高
爱因思念
螺旋网HelixNet
本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等
来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的
复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。

若本文侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email ：kaosy@ 告知。

此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷，
敬请不吝赐教，联系方式：kaosy@ 同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能
保证实验100%的成功，仅供参考。

写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可
以让大家理解一些不常见的符号及意义。

下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL
一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。

目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.主要优点
1)
具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)
作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)
营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)
可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)
表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)
在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。

P . pastoris 表达的糖蛋白的糖链长度为
8-14个甘露糖，而S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达50-150个；S. cerevisiae 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有
终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。

2. 毕赤酵母常用的菌株类型
2.1Mut+和Mut s
在毕赤酵母基因组中有2个醇氧化物酶编码基因，即AOX1基因和AOX2基因。

菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1基因表达的AOX1蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2酶蛋白，这就是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Mut s产生的原理。

当菌株基因组中既有AOX1基因，也有AOX2基因时，菌株的表型为Mut+该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。

当菌株基因组中仅有AOX2基因时，菌株的表型为Mut s，该菌株在有甲醇的培养基中生长缓慢。

2.2 菌株GS115、KM71和SMD1168的区别
GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。

GS115、KM71、SMD1168 是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。

GS115 表型为Mut+。

重组表达载体转化GS115 后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Mut s，可以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。

SMD1168 和GS115 类似，但SMD1168 是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。

KM71 没有AOX1 基因，本身就是Mut s。

因此转化后所有的转化子都是Mut s，不必鉴定表型。

3. 毕赤酵母菌株的生长
毕赤酵母适宜的生长温度是28至30度，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。

关于毕赤酵母的生长速度:
在YPD培养基中，不论是Mut+还是Mut s其在对数期增殖一倍的时间大约为2h
Mut+和Mut s菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的
存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时
存在甲醇的情况下，Mut s在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时
二、 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式
通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。

这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。

常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。

单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的1-10%。

1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点
GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。

因为插
入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Mut s表型。

图1重组质粒插入3’AOX1
2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交换事件(取代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Mut s表型。

以AOX1 位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表型。

基因取代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达盒。

基因取代
（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。

图2AOX1 位点的基因被取代
3. 基因插入His4位点
GS115（Mut+）或KM71（Mut s）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之间发生单交换事件，结果在his4位点
插入一个或多个基因拷贝。

由于基因组上AOX1 或aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株
相同。

图3 质粒插入形成双拷贝HIS4/his4 基因
4. 多拷贝插入
尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，还是很容易在转化子中筛选到插入多
拷贝的表达核的转化子。

其插入示意图如下：
三、 毕赤酵母表达重组载体的构建
1．表达载体的选择
根据基因的表达定位及目的可以简单的将毕赤酵母的表达载体主要分为以下几类：
(1) 胞内表达载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。

该
类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。

(2) 分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等。

由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外
源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。

常用的分泌的信号序列主要是由89个氨基酸组成的α
交配因子(α- factor)的引导。

(3) 多拷贝插入表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K。

在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表
达量。

该载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

2．如果想要表达的重组蛋白具有天然的N端，应该将克隆的基因直接连接在Kex2蛋白酶的切点后
Kex2蛋白酶切割的位置在信号肽序列中精氨酸和谷氨酸连接处：
Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala “*”位置为Kex2蛋白酶切割位点。

Ste13蛋白酶切割的位置在信号肽序列中谷氨酸和丙氨酸重复处：
Glu-Ala*-Glu-Ala* “*”位置为Ste13蛋白酶切割位点。

酸（1193-1195），以保证重组蛋白被有效切割。

在成功表达重组蛋白以后需要对其进行N端测序来最后确定其是否正确
切割。

四、 几种酵母转化方法的比较
1. 线性化
酵母转化的第一步是做线性化，不同的酶可以产生不能的效果，常用的酶主要有以下四个，产生的表型如下：限制酶插入事件 GS115表型 KM71表型
Sal I或StuI 插入his4 His+Mut+ His+Muts
Sac I 插入5’AOX1 His+Mut+ His+Muts
Bgl II 取代AOX1 His+Muts His+Muts（不推荐）
2. 转化方法
几种酵母转化方法的比较
转化方法转化效率(per μg) 方便因素多拷贝整合
原生质体法105低可以
电击转化105高可以
PEG1000 103高无
LiCl 102高无
附英文原版以防我翻译的可能不准（Pichia Protocols 28页）
3. 毕赤酵母的电击感受态的制备及电击转化
(1) 感受态的制备：
a) 挑取酵母受体菌的单菌落接种于10mLYPD培养基中，30℃摇床过夜。

b) 以1 %接种量转接100mLYPD液体培养基，30℃摇床过夜至OD=1.3-1.5。

c) 4℃离心5000rpm,5min,弃上清。

d) 用100mL冰预冷无均水将菌体重悬。

e) 4℃离心5000rpm,10min,弃上清。

f) 用50mL冰预冷无均水将菌体重悬。

g) 4℃离心5000rpm,10min,弃上清。

h) 再用20mL 1 mol/L的山梨醇洗涤1次
i) 溶于200uL 1mol/L的冰预冷的山梨醇，以备转化
很多朋友问，感受态做好了可以在-80度放么?
在这里我给出我自己的一点实验心得，酵母感受态尽量要现用现做，因为转化的效率有很大的影响，我现做的感受态的转化效率最高阳性率约为20%左右，以前不是使用现做的感受态一般的阳性率在1%-2%。

很多朋友说自己的阳性率比较低，可以考虑一下是不是感受态的问题。

(2) 毕赤酵母的转化
在80μl酵母感受态细胞中加入用合适酶切位点线性化的质粒1-5μg冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中（冰预冷），电击，迅速加入山梨醇，涂板。

感受态尽量现用现做，电击以后直接涂板，不需要活化。

一般在MD上3-4天会长出肉眼可见的菌落，在RDB上需要4-5天可以长出肉眼可见的菌落。

至此感受态及转化已经完成。

在这里我要强调一下重组质粒的含量一定要在1-5μg，而且越高越好，越纯越好。

我一般在酶切以后，将切好的基因片段用乙醇沉淀后溶于10μl待转化就好。

线性化质粒的含量也对转化效率有很重要的影响，切记。

很多找不到阳性重组子的朋友，可以考虑一下是不是这个问题。

4. 原生质体方法转化毕赤酵母
(1)原生质体方法转化毕赤酵母原理
原生质细胞的解释：毕赤酵母细胞壁阻止摄入DNA，有必要去除部分细胞壁以助于吸收DNA。

藤黄节杆菌酶是一种葡聚糖酶，可在细胞壁水解葡聚糖的β-1,3 接头，部分地消化细胞壁。

该方法的关键在于不能过度消化细胞壁，否则会导致细胞死亡。

而藤黄节杆菌酶消化能力受细胞对SDS 敏感性的影响。

因此其消化程度可以通过加入SDS进行控制，以产生适当浓度的原生质细胞。

一般经验，获得70%原生质细胞时，效果最好。

准备：制备下列溶液，存于4 度。

YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）培养基 1L
YPD 平板 1L
RDB（Regeneration Dextrose Base）平板 1L
RDHB（Regeneration Dextrose Histidine Base）平板 1L
转化当天，配制下列试剂：存于4 度
5% SDS溶液
RD（Regeneration Dextrose）融化琼脂 100mL
溶液：细胞去壁及转化试剂
1M 山梨醇
SE: 1M 山梨醇, 25mM EDTA pH8.0
DTT: 用水配制成1M浓度
SCE： 1M 山梨醇, 1mM EDTA , 10mM 柠檬酸钠缓冲液 pH5.8
CaS: 1M 山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2
藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/mL 的浓度
40%PEG：用水配制40%（w/v）PEG3350(试剂纯)
CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2
SOS: 1M山梨醇, 0.3×YPD, 10mM CaCl2
每次转化时配制：
SED：19mLSE 加1mL 1M DTT
PEG/CaT: 1:1 混合40%PEG 及CaT
(2) 感受态的制备
a) 在YPD 平板上划线培养GS115 或KM71,28－30 度培养2 天，以得到的单克隆细胞。

b) 在50mL离心管或100mL 摇瓶中，从GS115 或KM71 平板上挑取单个克隆接种10mLYPD，28－30 度剧烈振
荡（250-300rpm）过夜。

该培养物可在4度保存数天。

c) 在3 个500mL 培养瓶中加入200mLYPD，分别取5、10 及20uL 第2 步中的细胞，于28-30 度剧烈振荡
（250-300rpm）过夜
d) 第二天早上，取出转化溶液（SE，SCE，灭菌水，SOS，PEG，CaS,1M 山梨醇），RDB平板（用于转化）、
RDHB平板（活力对照），放置于室温下。

e) 测每个培养瓶中的OD600 值
f) 收集OD600 值为0.2-0.3 瓶中的细胞，室温，1500g离心5-10min。

去除上清，接下去准备细胞去壁
注意：如果培养基都超过0.3，选择一个培养基，用新鲜培养基以1：4稀释，28-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3（2-4 小时）。

收集细胞如第6 步
准备细胞去壁的试剂：取得上述第6 步细胞
a) 取100mL融化的RD琼脂糖，存于45 度
b) 解冻1 管1M DTT
c) 为该次去壁细胞试验准备新鲜的SED
无菌条件下，将19mLSE 转入合适的灭菌容器中（如50mL离心管），加1mL 1M DTT混合均匀，为得到最好的效果，SED 现配现用
注意：DTT 的质量及新鲜度是成功制备去壁细胞的关键，1M DTT 分析纯，-20 度保存。

洗涤细胞：
a) 用20mL灭菌水悬浮洗涤细胞，转入灭菌的50mL的离心管中
b) 室温1500g 离心5min，收集细胞
c) 将细胞重悬于20mL新鲜的SED中洗涤，如2 离心
d) 用20mL 1M 山梨醇洗涤，离心如2
e) 用20mL SCE 缓冲液重悬细胞，将悬液分至两个50 mL离心管中(10mL/管)
f) 取1 管藤黄节杆菌酶置于冰上，轻弹管壁以混匀，藤黄节杆菌酶以浆液的形式存在，无需配成溶液，将它混匀
以确保每次的量是相等的。

加入藤黄节杆菌酶：可先取一管细胞来确定用藤黄节杆菌酶消化细胞的最佳时间，一旦确定时间，取另一管细胞进行裂解。

藤黄节杆菌酶消化细胞壁，使细胞变脆，拿样品时要轻柔些，加入藤黄节杆菌酶后，即开始消化细胞壁。

准备至少20mL 5%SDS溶液
将分光光度计调至800nm处，用800uL 5%SDS及200uL SCE作空白
准备10 个灭菌离心管，编号0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50
a) 取5 步中一管细胞，取出200uL 加入标0 的管中，置于冰上，此即0 点
b) 加7.5uL 藤黄节杆菌酶到该管剩余细胞中，轻轻颠倒混匀，30 度孵育，不要晃动样品。

该样品可用于建立细胞
去壁最佳时间表。

将另一管细胞置于室温，用于第六步。

将剩余藤黄节杆菌酶放于冰上。

c) 监测去壁细胞的形成：2min时，取200uL 步骤2 中的悬浮细胞，加入标2 的管中。

在t=4,5,6,,,50min时，重复
上述操作，读样品OD800 值
用公式确定每个时间点时去壁细胞的形成比例：
%去壁率=100-［(时间t 时OD800值/时间0 时OD800 值)×100］
如t=0 时，OD800=0.256， t=15 时，OD800=0.032
计算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5%
确定去壁率为70%时的时间，藤黄节杆菌酶的用量不同，最佳时间也各不相同。

Invitrogen 实验室的最佳去壁时间为15-40min。

注意：确定获得所需量去壁细胞的最小时间很重要，藤黄节杆菌酶消化时间过长，对细胞有害，效率会降低。

d) 在另一管中加入7.5uL 藤黄节杆菌酶(如步骤1)，将管放于30 度，时间为步骤5 中建立的最佳时间，以获得最佳
比例70%的去壁细胞。

e) 室温750g离心10min，收集去壁细胞，去除悬浮液
f) 用1M山梨醇洗去壁细胞1 次(轻叩管壁以分散去壁细胞团，不要涡旋)。

如上离心9 用10mL CaS洗涤去壁细胞，
如7 中离心，用0.6mLCaS 重悬细胞。

去壁细胞必须立即(至多30min)用于转化。

不能放更长时间，这些细胞共可作6 次转化
(3) 转化毕赤酵母
开始前：将RDB 平板放于室温，准备好融化的RD 上层琼脂，取出线性化DNA 置于冰上
步骤：
a) 取上述9中100uL去壁细胞到1.5 mL灭菌的有盖管中
b) 取10ugDNA，室温孵育10min
c) 同时配制PEG/CaT 溶液，计算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)
d) 加1mL 新鲜的PEG/CaT溶液至细胞与DNA 混合物中，轻轻混匀，室温孵育10min
e) 室温750g 离心10min，小心抽吸PEG/CaT 溶液，颠倒管，轻叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

f) 用150uLSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min
g) 加入850uL1M山梨醇，接下来涂板
涂板：毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上，以防止在选择前被裂解
a) 接第g 步，取100-300uL去壁细胞-DNA，与10mL 融化的RD 琼脂糖混匀倒于RDB 平板上，直至上层琼脂变硬。

注意，确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板，第三板
b) 倒置平板，28-30度孵育，转化子会在4-6 天内出现
c) 细胞活性：用100uL 去壁细胞加入900uL 1M山梨醇
d) 取稀释样本100uL，加入10mL融化的RDH，铺在RDHB 平板上，等上层琼脂凝固
e) 倒置平板，28-30度孵育，4-6天出现克隆，表明去壁细胞可再生成分裂细胞
五、 阳性毕赤酵母菌株的筛选
1.用PCR的方法检测重组菌株表型
检测用引物为5’AOX1引物和3’AOX1引物，如果是Mut+，应该有两条带，一条为大约2.2kb的AOX1基因，另一条为略大于你的目的基因条带，具体大多少请参考手册及你所使用的载体。

1) 平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2) 将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。

引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者或
者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3) 用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，先在YPD平板上点一下，然后再在PCR管中涮以下对PCR
管和YPD平板上的编号要对应；
4) PCR扩增，1％ agarose电泳；
5) 对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，可以再进行后续的分析。

注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多，使用PCR初筛可以使工作量大为降低。

当然也可以提取毕赤酵母的基因组进行进一步的分析验证，以下为一种提取毕赤酵母基因组的方法。

1) 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。

2) 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体
uLTE（pH 7.0）重悬，加入300 uL EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 uLβ-巯基乙醇，1uL Lyticase ，
3) 100
37℃水浴30 min。

4) 10000g离心5~10min，取沉淀，加90uL TE重悬。

5) 200uL 饱和酚，200uL氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。

6) 加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；
7) 10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；
8) 干燥后，加入15 μl的TE或H
O溶解，-20℃备用。

2
2.Mut+及Mut s的筛选
1) 用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD 平板上以一定的方式划线或点HIS+转化子，
2) 保先在MM平板上点
3) 每个克隆换一次牙签，点100 个转化子后再继续向下做(约2-3 板)
4) 30 度孵育2 天
5) 两天后，计数平板，寻找在MD 平板正常生长而在MM 平板上生长很小或不长的菌株该菌株为Mut s型，其余为
Mut+类型。

注意：建议先纯化HIS+转化子，确保分离的是单克隆，这可在检测Mut表型前进行。

3.筛选多拷贝转化子的方法
1) 技术上简单，可筛选大量克隆，但不那么可信。

筛选HIS+转化子后，将它们集起来，铺在遗传霉素浓度逐渐升高
的YPD 平板上，可应用于去壁细胞及电转化方法。

技术上较难，只可筛选少量克隆，但更可信。

2) 每个克隆在微量测定板上生长至浓度一致，将培养基点到YPD-遗传霉素平板上计算抗遗传霉素抗性。

3) 注意：用遗传霉素筛选可能会有假阳性。

划线挑取假定的抗遗传霉素单克隆，然后在YPD-遗传霉素平板上进行
证实很重要。

如果你真的选择复制平板，一定要证实遗传霉素抗性。

六、 毕赤酵母诱导表达的方式
1. Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
1) 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至
OD600 = 2-6 (16-18 h)；
2) 室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或 BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100-200ml）；
3) 将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30度/250-300 rpm的摇床上继续生
长；
4) 每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
5) 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，
分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；
6) 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C
保存备用；
7) 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

2. Muts表型重组酵母的诱导表达实验
1) 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30度/250-300 rpm培养至
OD600 = 2-6 (16-18 h)；
2) 室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM、BMM或 BMMY重悬菌体（约10-20ml）；
3) 将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续
生长；
4) 每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
5) 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分
析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；
6) 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C
保存备用；
7) 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

七、 蛋白质表达实例
在本章中我们通过表达一个酶蛋白的实例，来深入了解毕赤酵母表达系统的流程。

在本章中，我认为认为大家已经熟练掌握基因工程技术中所涉及的引物设计、PCR，载体构建、酶切酶联等常规实验技术。

在开始实验之前，你应该尽量多的去了解毕赤酵母表达系统，因为酵母表达系统与平时使用的大肠杆菌表达系统，还是有很多区别。

首先其生长速度要慢很多，所以实验的进度也会相应的慢些。

在阳性重组子的筛选及表达蛋白鉴定方面，一些做酵母的同仁尤其是新人也会出现许多问题，很多人卡在这里几个月甚至一年之久。

所以建议在做之前，一定要弄懂酵母表达系统中的一些基本原理，让自己在实验的时候做到得心应手。

采用毕赤酵母表达系统进行重组蛋白表达，只要你掌握常规的基因工程技术，并了解了酵母的特性以后，是很容易的，下面我把从基因克隆一直到重组蛋白表达分为几个实验步骤，简单介绍一下整个表达过程。

1、目的基因的获得
2、毕赤酵母重组表达载体的构建及鉴定
3、用限制性内切酶对重组表达载体进行酶切
4、毕赤酵母感受态的制备及转化
5、毕赤酵母阳性重组子的筛选及鉴定
6、重组酵母发酵产目的蛋白条件的优化
1目的基因的获得、信号肽编码序列的去除及真核表达载体的构建
通过在线预测信号肽http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，将目的基因的信号肽去除。

以去掉信号肽的基因为模板，设计一对含有酶切位点的引物进行扩增，得到目的片段后可以选择酶切直接连接载体（注意这种方法需要加保护碱基），或连接T载体做亚克隆，测序正确后将目的基因切下来与毕赤酵母表达载体进行连接，得到目的重组载体（推荐该
方法）。

关于为什么去掉信号肽：首先，毕赤酵母分泌型表达载体含有信号肽a-factor，如果在你的基因前还有信号肽，可能造成N端有多余的序列，是由你的基因的信号肽不会被正确切割所导致。

2毕赤酵母感受态的制备及转化
可以选择电击转化或原生质体转化。

3阳性重组子的初步筛选
一般需要进行组氨酸筛选、Mut+或Muts类型筛选、多拷贝筛选等。

4对得到阳性菌株的诱导培养
针对Mut+或Muts类型，按照正确的条件进行正确诱导表达，见第六章。

5关于基因的优化
(1) 密码子的偏好性的原则
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。

了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。

(2) RNA高级结构的避免
如果编码基因转录出的mRNA存在复杂的二级结构，这样往往会影响到外源蛋白质的翻译。

在基因的设计过程中应该尽量避免这种高级结构的存在。

(3) 蛋白酶水解或降解
如果分泌表达，在无缓冲的MM培养基中培养，检测蛋白是否对中性PH 蛋白酶敏感。

另外，在缓冲培养基中加入1%酪蛋白氨基酸，抑制胞内蛋白酶对外源蛋白质的降解。

还可以用SMD1168(蛋白酶A 缺陷)进行表达。

八、 毕赤酵母表达常用培养基
1. 10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存；
2. 500×B（0.02%生物素），生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存；
3. 10×D（20％葡萄糖），200gD-葡萄糖溶于1L水，过滤灭菌，4℃保存；
4. 10×GY(10%的甘油)，100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存；
5. 100×AA(含每种氨基酸0.5％)，称取L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸各500g溶于100mL
水，过滤灭菌，4℃保存；
6. 1M的磷酸缓冲液(pH6.0)，将132mL1M的磷酸氢二钾（K2HPO4）和868mL1M的磷酸二氢钾（KH2PO4），用
磷酸和氢氧化钾调pH值到6.0, 过滤灭菌，常温保存；
7. YPD完全培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L（固体培养基含1.5%琼脂）
8. 转化培养基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，然后待温度降
至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4 g/L)，100×AA 1mL。

混匀，到平板（灭菌时只加入80ml水即可）。

9. 选择培养基MD：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后
在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4 g/L)
10. 选择培养基MM：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后
在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4 g/L)，0.5mL甲醇(0.5%)
11. 诱导表达培养基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至
890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4 g/L)，甘油10mL
12. 诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，
121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4 g/L)，甲醇5mL
13. 发酵培养基10×Basal Salts：NH4H2PO4 50 g/L，CaSO4 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，
KOH 3g/L，葡萄糖 50g/L，KH
2PO4 5g/L。