第1课时基因工程的基本工具

定时检测
1.(2009·福建理综)转基因抗病香蕉的培育过程 如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ 等四种限制酶切割位点。请回答:
(1)构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶
,对
进行切割。
(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞
的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香
是否需模板
不需要
需要
连接DNA链
双链
单链
作用过程 作用结果
在两个DNA片段之 间形成磷酸二酯键
将两个 DNA片段连 接成重组 DNA分子
将单个核苷酸加到已存 在的核酸片段的3′端 的羟基上,形成磷酸二 酯键
合成新的DNA分子
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)类型 最常用载体:质粒 其他载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等
基因组文库与cDNA文库的区别：
文库类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种之间的 基因交流
说明
cDNA文库
基因组文库
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本
操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优
点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
核心
第一步：目的基因的获取
1、目的基因的来源:
①从自然界已有的物种分离
②人工方法合成
2、获取目的基因的常用方法:
①从基因文库中获取 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成
目的基因的序列为未知的情况 目的基因的序列为已知的情况 目的基因不是很大、且序列为已知的
建”的环境。 (2)优点 ①与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。 ②与诱变育种相比：定向改造生物性状。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理: 基因重组。 (5)本质:甲(供体提供目的基因) 乙(受体表达目的基 因), 即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转 移。
2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图
功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象
是
。
①启动子 ②tms和tmr（2分） 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
你知道双酶切法吗？
（2010年江苏高考）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位 点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
基因工程的基本操作程序
合成基因 基因组文库 组织、器官、细胞
第一步： 目的基因的获取
基因文库பைடு நூலகம்
cDNA文库
目的基因的克隆
如何建立?
思考： 1、对照图解思考，什么是基因文库？ 2、基因文库有哪些类型？ 3、比较基因组文库和cDNA文库构建的不同点。
活动1： 体验基因文库的构建过程
分析基因文库构建过程的图解，思考问题：
现代生物科技专题
原核细胞基因的结构
非编码区 编码区上游
编码区
非编码区 编码区下游
RNA聚合酶
结合位点
调控遗传信息的表达
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游 启动子
与RNA聚酶 结合位点
编码区
外显子 内含子
非编码区
编码区下游 终止子
高频考点突破
考点一 基因工程的概念理解和理论基础 1.基因工程的概念理解 (1)操作环境：体外——关键步骤“表达载体的构
的
盲
目
性
。
关于PCR技术扩增 ①概念：PCR全称为__聚__合_酶__链__式_反__应___，是一项在生物 _体__外_复制_特__定_D_N_A_片__段__的核酸合成技术。
②原理：_D_N_A_复_制_____。 ③条件：___已_知__基__因__的_核__苷__酸_序__列____、_四__种__脱_氧__核__苷_酸___、 __一_对__引__物____ 、耐高温DNA聚合酶 。 ④方式：以_指_数___形式扩增，即__2_n （n为扩增循环的次数）
TaqDNA聚合酶
同
点 引物
结果
RNA 形成整个DNA分子
DNA或RNA
在短时间内形成大量的 DNA片段
相
需提供DNA复制的模板
同
四种脱氧核苷酸作原料
都需要酶、引物、能量
点
利用PCR扩增目的基因
（2011江苏高考）请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制
基因 治疗
第三步：将目的基因导入受体细胞
式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因
为
。
(3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结 合到双链DNA片段的引物链上。
第二步：基因表达载体构建
合成基因 基因组DNA
组织、器官、细胞 cDNA文库
基因文库
目的基因的克隆
目的基因转移 转化或感染
第二步：基因表达载体构建
1.构建基因表达载体目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传 至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用 。
错位切：产生两个相同的黏性末端 平切：形成平末端
提醒 ①切割的化学键为磷酸二酯键。 ②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶, 目的是产生相同的黏性末端。 ③将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制 酶,同时产生4个黏性末端。 ④不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末 端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的 黏性末端不相同。
蕉细胞,应使基因表达载体A中含有
,
作为标记基因。
(3)香蕉组织细胞具有
,因此,
可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组
织细胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培
养过程中香蕉组织细胞的
。
答案 (1)PstⅠ、EcoRⅠ 含抗病基因的DNA、质粒 (2) 抗卡那霉素基因 (3)全能性脱分化、再分化
考点三 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
合成基因 基因组DNA
组织、器官、细胞 cDNA文库
第三步： 将目的基因导 入受体细胞
第四步： 目的基因的检 测与鉴定
基因文库
目的基因的克隆
目的基因转移 转化或感染
原核细 胞表达
真核细 胞表达
植物中 表达
动物中 表达
人体 表达
发酵 工程
转基因 植物
动物器官 发生器
转基因 动物
类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链
合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片
段所占的比例为
。
②在第
轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等
长的DNA片段。
(1)①15/16 ②三
利用PCR扩增目的基因
(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达
（基因），保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的
无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于
___________。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。
③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分
子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成
2.基因工程载体的构建需要考虑的因素 （1）基因的特点 （2）要选择强启动子 （3）要有选择标记基因
3.不同生物的DNA可以拼接在一起的原因： 所有生物的DNA的基本结构相同（不同生物
DNA都是由4种脱氧核苷酸构成，都具有双螺旋结 构，都遵循A-T、G-C的碱基配对原则）
4.基因表达载体的组成：
目的基因+启动子+终止子+标记基因
注意基因克隆载体与基因表达载体的区别
载体(vector）：
用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，
能自我复制的DNA分子。
（1）在基因克隆时：将目 的片段转移到宿主细胞中进 行复制克隆——克隆载体；
DNA片段 复制原点 标记基因 多种单一限制酶切点 合适大小
（2）在基因导入受体时： 将目的片段转移到受体细胞 中使目的片段稳定存在并表 达——表达载体。
体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把 环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。 ④注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和 作用都不相同。 ⑤质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞； 也可在体外复制。
⑥基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。 ⑦受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织培 养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物——大 肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的 胰岛素则必需用真核生物酵母菌——需内质网、高 尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营 寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它 无细胞核,不能合成蛋白质。
②退火（55℃-65℃）：引物与DNA模板结合，形成 局部双链。
③延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下从引物起 始进行互补链的合成。
PCR扩增与细胞内DNA复制的比较
细胞内DNA复制
PCR扩增
解旋
在解旋酶作用下
90℃-95℃高温解旋，
方式 边解旋边复制（主要细胞核）
双链分开（体外）
不
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶
√
√
√
×
与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、 外源DNA的优点在于可以防止__质粒和含目的基因的外源_D_N__A__片__段__自__身__环__化_。
将同一种限制酶切割的质粒与目的基因片段混合， 加入DNA连接酶，两两连接的产物有几种？
目的基因与目的基因的连接物 目的基因与质粒的连接物 质粒与质粒的连接物
启动子、终止子以及起始密码子、终止密码子所存在的位 置及作用？
启动子、终止子存在于DNA上； 起始密码子、终止密码子存在于mRNA上。
启动子并不是转录的起点，是RNA聚合 酶识别和结合的位点; 起始密码子是翻译的起点。
（08年江苏高考）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲 喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的 图和表。
⑤结果 ： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增. 。
思考：
1、PCR扩增过程中是否需要另外加入ATP？为什么？ 2、PCR扩增过程中设置三种温度的作用分别是什么？ 3、PCR扩增与DNA复制的区别是什么？
PCR扩增过程中设置三种温度的作用分别是什么？
①变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
提醒 ①质粒本质是DNA,不是细胞器;②特点:小 型环状。 (2)功能：将目的基因导入受体细胞。 (3)应具备条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； ②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因
连接； ③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。
提醒 ①一般来说,天然载体往往不能满足人类的 所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某 些天然的载体进行人工改造。 ②常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色 的表达产物基因、发光基因等。 ③作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶 的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别 单一切点,若载体上有一个以上的酶切点,则切割 重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起 点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载
温和噬菌体： 感染宿主细菌 后不引起细菌 裂解,而与宿主 细胞建立共生 关系并随细菌 繁殖传给细菌 后代。
什么意思？ 怎么做？
解读cDNA文库 的构建过程
(1)提取某种生 物发育的某一 时期的mRNA;
(2)mRNA反转录 形成DNA片段;
(3)DNA片段与 载体连接后,储 存在一个受体 菌的群体中。
考点二 基因工程的操作工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)化学本质：蛋白质。
(3)作用 催化作用,所以可重复利用
可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割 (4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱
氧核苷酸序列,切割特定位点。
(5)切割方式
目的基因 启动子和终止子
复制原点 标记基因 多种单一限制酶切点 合适大小
活动2： 体验基因表达载体的构建过程
下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因 及部分限制性内切酶作用位点），思考回答：
×
×
√
√√
√
√ √
①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入____________。
②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 功能
大肠杆菌 连接黏性末端
T4噬菌体
连接黏性末端或 平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键
拓展提升 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA 连接酶
DNA 聚合酶
作用实质
都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯 键