核酸与蛋白质相互作用研究的新技术与新方法[1]

收稿:2003年4月,收修改稿:2003年7月

　3国家杰出青年科学基金(N o.20025311)、国家自然科学基金重大项目(N o.20299034)资助33通讯联系人　e 2mail :dw pang @

核酸与蛋白质相互作用研究的新技术与新方法

3

吕鉴泉

1,2

　庞代文

133

(1.武汉大学化学与分子科学学院　武汉430072;2.湖北师范学院化学系　黄石435002)

摘　要　蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子,两者的相互作用构成了诸如生长、繁殖、运动、遗

传和代谢等生命现象的基础。因此,研究它们间的相互作用是人们解开生命奥秘的关键所在,在学术及应用上都具有极其重要的意义。探讨蛋白质和核酸相互作用涉及到众多学科的技术与方法,是多学科的前沿交叉领域。总体上该方面工作尚处于起步阶段,深入研究有待于研究手段的进步与创新。本文从研究手段与分析方法上对近年来该领域所采用的技术及其最新进展进行了评述。

关键词　新技术　相互作用　核酸　蛋白质中图分类号:Q51;Q52　文献标识码:A 文章编号:10052281X (2004)0320393207

N e w Techniques and Methodologies for the I nvestigation

of the I nteractions of Nucleic Acids with Proteins

L üJianquan

1,2

　Pang Daiwen

133

(1.Department of Chemistry ,Wuhan University ,Wuhan 430072,China ;2.Department of Chemistry ,Hubei Normal University ,Huangshi 435002,China )

Abstract Nucleic acids and proteins are m ost im portant biomacrom olecules.G enome regulation is critical step for all organisms.Protein 2DNA interactions play a key role in biological processes.The current technologies and methodolo 2gies for the investigation of the interactions of nucleic acids with proteins are summarized ,and the perspectives on the fu 2ture development are als o proposed.

K ey w ords new techniques ;interaction ;nucleic acids ;proteins

生命科学是20世纪最重要的前沿研究领域之

一,其重点在于了解各种生命活性物质的结构、功能

及它们间的相互关系[1]

。蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子,它们各自具有其结构特征和特定功能。核酸具有传递遗传信息等功能,而蛋白质则贯穿生命的所有生理过程。宏观上,两者的配合与作用构成诸如生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命现象的基础。

目前,DNA 的测序研究已告一段落,DNA 的多级结构、类别和组成及其碱基对的连接次序已弄清,许多DNA 结合蛋白质(含它们的DNA 复合体)的结

构及其基元(m otif )相继被确认[2]

。蛋白质组(蛋白

质的组成、结构和功能)的研究正在蓬勃兴起[3]

。由

于蛋白质种类繁多、结构及其构象(空间结构)十分复杂,蛋白质组的研究尚需要投入大量的人力、财力

和物力[4]

。但基因组和蛋白质组的研究仅仅是揭开生命奥秘的序幕,生命科学的核心工作在于在表征各种生物分子的结构、弄清各类生物分子功能的基础上,通过对它们间相互作用的表述进而掌握物质代谢、信息传递规律并实施调节及调控。许多复杂的课题已经紧迫地摆在科学家面前,蛋白质和核酸的相互作用就是其中的一个重要领域,是今后一段

时间内亟待研究的重大课题[5]

。

对于蛋白质和核酸的相互作用,过去曾用生物

第16卷第3期2004年5月

化　学　进　展

PROG RESS I N CHE MISTRY

Vol.16No.3

　May ,2004

化学和分子生物学方法开展工作并取得了一些宏观认识[6];近几年,科学家们采用先进的手段从微观上作了一些有益的研究。从研究手段上看,它涉及到各种常规测试手段和新近发展的先进技术;从研究方法上看,它主要表现在作用位点和序列方面的识别研究、机理及作用特征等的探讨。鉴于此方面工作的深入有待于研究手段的进步与创新,本文拟从研究手段和技术方面评述这些研究的最新进展,以期促进我国在该前沿领域开展系统研究工作。

一、荧光技术

对于生物样品的研究来说,荧光法是一种应用频次最高、成果最为丰富且有效的手段,它具有灵敏度高、选择性好的特点。但由于核酸及其构成核酸的碱基的荧光量子产率很低,组成蛋白质的20余种氨基酸中只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然荧光,常规的荧光技术在使用时受到了很大的限制。目前用于研究蛋白质和核酸相互作用所采用的荧光法,主要集中于将荧光分子修饰到蛋白质Π核酸分子上构成新型荧光标记物质和结合仪器改造的新型测试技术。

Daniel通过用匹配有单光子计数雪崩式光电二极管照明的共焦显微镜来检测单个荧光标记DNA 片段的办法,以插入式噻唑橙染料和噻唑橙为探针研究了DNA与特异序列锌指接合物(zinc finger)的键合动力学[7]。结果表明,非结合的噻唑橙与ds2 DNA在ms级内仅有动态作用,而在染料2蛋白质中的噻唑橙则在很长时间内与DNA保持着结合状态。

T achiiri将DNA分子的一端固定于一载玻片上,另一端用荧光探针标记。荧光视频显微镜观察到,添加了核酸外切酶Ex o III和Mg2+或单链DNA结合蛋白质(single stranded DNA binding protein,SS B)后DNA的活动半径明显减少并导致单链DNA的扭曲,其原因在于DNA分子在Ex o III的作用下发生了水解[8]。T aylor将具有位点特异性的限制性内切酶EcoRI连接于20nm荧光纳米粒子上,该结合体在Mg2+存在下,对双链DNA有特异性序列结合,并可直接用多色荧光显微镜观测。该项研究为基因进行光学成像和DNA2蛋白质作用的基础研究展示了新的可能性[9]。

Duhachek设计了Au基上的单克隆抗体生物芯片,发现低温下可检出鸟嘌呤衍生物BP262N7的激光诱导荧光光谱,而室温下不能检出产生的荧光,据此建立了高分辨率低温荧光光谱直接对致癌物质(carcinogen)2DNA加合物的定量检测方法[10]。Wan 采用毛细管电泳2激光诱导荧光技术研究了单链DNA结合蛋白质的反应,结果表明不同核苷酸标记的荧光探针因蛋白质2DNA复合物的计量系数不同而呈现不同的各向异性和电泳淌度[11]

。

图1　分子信标原理

Fig.1　Mechanism of m olecular beacons[12]

分子信标(m olecular beacon,M B)是一种设计巧妙的新型荧光标记探针[12],其原理如图1所示。其茎秆区互补序列的结合能使探针分子形成“发夹”结构,发夹的两端分别连接荧光分子(F)及猝灭分子(Q)。自由状态下,发夹结构两端的F与Q非常接近,荧光几乎完全被猝灭,此时荧光本底值极低。当分子信标与序列互补的靶分子形成杂交体时,信标茎秆互补区被拉开,F与Q距离增大,信标分子的荧光能够恢复。这样通过分子信标技术可以在靶序列扩增的同时进行探针杂交并显示其进程。

Fang设计了单链核苷酸的分子信标荧光探针,研究了它与各种同功酶的结合作用,发现它与乳酸脱氢酶(LDH)1∶1结合[13];在液2固界面上它与目标DNA或RNA分子结合时发出很强的荧光信号[14]。此项工作对于蛋白质的快速、实时检测及研究蛋白质2DNA相互作用具有十分重要的意义。

量子点(quantum dots,QDs)是一类新型的荧光标记物。所谓量子点是一类半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒,因具有特有的量子尺寸效应和表面效应,在发光材料及光敏传感器等方面得到广泛应用[15]。特别是Nie小组用量子点对编码生物分子的突破性研究[16],更是展现了量子点在生物化学、分子生物学等领域的极大应用前景[17,18]。

Mahtab等合成了具有蛋白质大小且表面富含Cd2+的CdS QDs,该QDs能够与不同形状的DNA结合,并依据平衡常数以及荧光猝灭速度的差别可以区分“直链”、“弯曲”或“扭结”的DNA,以此建立了

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