进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法

《保健食品中育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非含量的测定方法液相
色谱-质谱/质谱法》编制说明
一、任务来源
本标准是根据国家认监委下达的计划编号为“2009B568”制标任务编写的。

本标准由湖南出入境检验检疫局承担研究和起草。

二、研究目的
育亨宾又称痿必治为非激素类药物，最早是从产于西非洲一种植物(Corynante Yohimbe)树皮中提出的一种生物碱,现已有合成品。

自古以来育亨宾即在非洲用作催欲药，1900年哥维及苗勒等应用于因神经衰弱所致的阳萎及麻痹性不感症取得疗效，因而用于临床。

其药理作用能使血管平滑肌扩张，降低交感神经张力，通过扩张阴茎的动脉，增加阴茎海绵窦血流量；使阴茎勃起，并使中枢性交感神经兴奋。

适用于精神性、神经性、血管性及糖尿病性阳痿。

是目前较为肯定而且应用最多的一种植物性治疗勃起功能障碍的药品，一般服用剂量为500mg。

但育亨宾并不适合正在服用抗忧郁剂的人仕服用﹐也不适合患有肾脏疾病或胃溃疡者服用。

此外，服用高剂量的育亨宾可能会导致严重的副作用﹐包括丧失肌肉功能﹐血压升高，忧虑﹐心悸﹐眩晕等。

对有些人而言，育亨宾能引起幻觉。

某些食物如芝士﹐动物肝脏﹐红酒等﹐也应避免与育亨宾同时进食﹐以免令血压升高。

西地那非俗称伟哥，磷酸二酯酶-5（inhibitor of phosphodiesterase type 5,简写PDE-5）选择性抑制剂,原为一种抗心绞痛的新药，由于其在临床试验中被发现有治疗男性勃起功能障碍（Erectile dysfunction,ED）的作用而改变了研发方向，一般在用药后40 min 见效，剂量为50 mg。

与其作用相似的药物还有德国Bayer与葛兰素史克公司联合开发的伐地那非，于2003 年8 月获得FDA 批准在美国上市，此药用后10 min 起效，一般剂量为10 mg，对PDE-5的抑制能力是西地那非的5倍，因而在临床上5、10、20 mg伐地那非的作用相当于25、50、100 mg 西地那非的作用。

美国Lilly公司开发的他达拉非，商品名他达那非也获得欧盟批准上市，其对磷酸二酯酶5有更好的选择性，促进阴茎勃起的效果可长达36个小时。

他达那非的平均起效时间是16 min。

服用量为10-20 mg，建议东方人服用量为25-35 mg。

磷酸二酯酶5抑制剂的不良反应主要表现在中枢神经、循环和视觉系统，常见有头痛、面部潮红、焦虑、消化不良、腹部不适、肌痛、骨痛、血尿；循环系统表现为心律失常、心梗、心脏猝死、脑出血、高血压；视觉系统表现为对光敏感、视力模糊、复视、眼肿、眼压高、视物蓝绿。

磷酸二酯酶5抑制剂18岁以下的人禁用，对在6个
月内曾发生过心梗、中风、致死性心律失常、低血压或高血压者、不稳定心绞痛者、冠状动脉病和视网膜色素沉着患者慎用。

对阴茎畸形者慎用。

急性冠状动脉综合征、冠心病明显缺血、心力衰竭、急性心梗、中风、心律失常者忌用。

对有出血性疾病或胃溃疡、遗传性色素性视网膜炎、脊髓损伤等中枢神经系统病、盆腔手术或创伤及接受放疗者慎用。

当服用较大剂量的西地那非时会引起头痛、消化不良、头晕、皮疹等不良反应，更为严重的是，西地那非能增强硝酸酯类药物的降压能力，与任何一种短效或长效的硝酸酯类药物同时使用时，可能会引起致命性低血压反应，甚至导致突然死亡。

育亨宾、西地那非、伐地那非、他达那非等均为处方药，因此在性保健品中被禁止使用，目前不法保健品厂商为了使产品到达中药难以达到的快速效果，在一些保健食品中加入这些违禁药物，严重威胁了服用者的身体健康，影响出口保健品的信誉。

卫生部和中国食品药品管理局等部门多次发文（如《卫生部、国家经贸委、工商总局、药品监督局关于开展保健食品专项整治工作的通知》（卫法监发[2002]172号）要求查处保健食品中添加此类药物的违法行为，因此对保健品中的壮阳违禁药物进行检测具有非常重要的意义。

育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非化学性质信息见表1。

三、国内外研究现状
目前，国外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法报道较少[1-4]，且多为单个或两个同时检测的方法，国外报道的较多，有液相色谱-紫外检测法、气相色谱-氢火焰检测法、ESI-HPLC-MS 法及ESI-LC/MS/MS等[5-15]，但对育亨宾的检测鲜有报道，更未见同时检测保健食品中这四种违禁药物的报道，因而该方法具有创新性和现实意义。

国内外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表见表2。

表 1 育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非的基本化学信息
表2 西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表
四、术语（《中国药典2005 年版》）
片剂：系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，抗疲劳保健食品
只要是口服普通片。

胶囊剂：系指药物或叫加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。

抗疲劳
保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类，供口服用。

硬胶囊（通常称为胶囊）：系采用适宜的制剂技术，将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。

软胶囊：系将一定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在适宜的敷形剂中制
备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中的胶囊剂。

可用滴制
法或压制法制备。

软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独或混合制成。

口服溶液剂（药酒与口服溶液剂一致）：系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。

五、方法论证
1、样品制备
本标准方法的样品制备按照《中国药典2005 年版附录I 制剂通则》的取样量及药典相关剂型制备方法进行。

对于片剂、胶囊剂进行检测时，最大的取样量均为20 片（粒），口服溶液剂最大的取样量均为10 支。

片剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 片，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。

硬胶囊试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 粒，倾出内容物，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。

软胶囊试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 粒，将内容物全部挤到一离心管中，在混匀器上充分混匀，作为试样。

口服溶液剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品10 支（瓶），取等量体积样品到同一容器中混匀作为试样。

2、试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

2.1 甲醇：液相色谱级。

2.2 乙腈：液相色谱级。

2.3 乙酸：优级纯。

2.4 0.1 %乙酸水溶液∶甲醇混合液：1+1（V/V）。

2.5 育亨宾（yohimbin）CAS号：146-48-5，分子式：C21H26N2O3）标准品纯度大于等于99.0%。

2.6 他达那非（tadalafil，CAS号：171596-29-5，分子式：C22H19N3O4）标准品纯度大于等于99.0%。

2.7 西地那非（Sildenafil，CAS号：139755-83-2，分子式：C22H30N6O4S）标准品：纯度大于等于99.0%。

2.8 伐地那非（vardenafil，CAS号：224785-91-5，分子式：C23H32N6O4S·HCl）标准品：
纯度大于等于99.0%。

2.9 标准溶液：分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲
醇配制成浓度为10 μg/mL的混合标准储备液(4℃下避光保存6个月)。

根据需要用0.1 % 乙酸∶
甲醇混合液（4.4）将标准储备液稀释成1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL
的混合标准工作溶液(4℃下避光保存1个月)。

3 仪器
3.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。

3.2 超声波清洗器。

3.3 旋涡混匀器。

3.4 分析天平：感量 0.1 mg和 0.01 g各一台。

3.5 真空泵。

3.6 离心机。

4 质谱条件的确定
将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。

API 4000优化的参数为：雾
化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气，其参考值为：窗帘气（CUR）：20.00；
雾化气（GS1）：40.00 psi；辅助加热气（GS2）：45.00 psi；碰撞气（CAD）：7.00 psi；离
子源喷雾电压（IS）：5000.00 V；TEM：550.00℃；ihe：ON。

采用Syringe Pump 对4 种目标化合物进行质谱条件的优化(以育亨宾为例)
4.1 Q1扫描寻找母离子,为35
5.2。

图 1 Q1扫描图
4.2 进行DP扫描,确定DP电压为108v。

图2 DP 电压扫描图
4.3 Q3扫描确定子离子为144.1和212.4;进行CE 扫描和MRM 试验,确定两个子离子的最佳CE 值为30和50,EXP 值为1
5.
图3 子离子扫描图
同样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.
表3 4种目标化合物质谱条件
注：“*”为定量离子对。

5、色谱柱的确定
在上述质谱条件下，选择色谱柱COSMOSIL 5C18-MS-II Waters，2.1 × 150 mm, 5 μm；色谱柱2：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 × 250 mm, 5 μm；流动相组成：0.1%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱。

此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离，从实验室通用性考虑，我们采用了ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 × 150 mm, 5 μm。

6 流动相组成的确定
由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大，采用等梯度洗脱时，若有机相含量低，伐他达那非难以洗脱，提高有机相含量，不仅伐地那非、西地那非分离不佳，而且育亨宾洗脱速度太快，易产生离子抑制效应，影响定量分析，因而我们采取了梯度洗脱方式。

通过实验证明，在流动相中加入0.1%的乙酸，可以减少拖尾，优化色谱峰型。

经过实验证明，流速为500 μL/min，在下列梯度洗脱条件（见表4）下，4种目标化合物均得到了很好的分离（见图4）。

图 4 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图
5、标准曲线和线性范围
在所选择的LC/MS/MS 条件下，采用选择的定量离子，4种目标化合物在1ng/mL-100ng/mL 范围内成线性关系，线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。

图5 育亨宾定量离子对（355.2/144.1）线性曲线(r=0.9997)
图6 伐地那非定量离子对（486.5/151.1）线性曲线(r=0.9993)
图7 西地那非定量离子对（475.3/100.1）线性曲线r=0.9997
图8 他达那非定量离子对（390.4/268.3）线性曲线r=0.9996
超出线性范围后，应当对提取液进行适当的稀释，使得检测的响应在线性范围之内。

根据样品处理方法,在此浓度范围内，它们分别相当于样品含有目标化合物：固体样品为1.0 mg/kg～100.0 mg/kg的含量范围,液体样品为0.010 mg/L～100.0 mg/L.此时固体样品的检测定量低限为1.0 mg/kg，液体样品的定量低限为 0.01 mg/L，满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验要求。

图 9 育亨宾检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图
图 10 伐地那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图
图 11 西地那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图
图12 他达那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图
6、实验室内精密度实验
6.1 量取待测试样1.0 mL 于10.0 mL 容量瓶中，加入0.1 %乙酸l+甲醇（1+1，V/V）
经充分混匀后定容，过0.45 μm 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。

实验试样：氨基酸饮品，该试样不含待测违禁物。

表 5 氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果
图13试剂空白提取离子叠加色谱图
图14 氨基酸口服液提取离子叠加色谱
图15 氨基酸口服液添加10 μg/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图16氨基酸口服液添加50 μg/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图17 氨基酸口服液添加100 μg/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率
称取碾碎混匀的样品1.00 g于100 mL 容量瓶中，加入80 mL甲醇于超声波清洗器中超声处理30 min 后，取出冷却，用甲醇定容并充分混匀，定量取1.0 mL 提取液于10.0 mL 容量瓶中，用0.1%乙酸+甲醇(1+1)定容后混匀，过0.45μm 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。

我们选择了可邦男性抗衰老片作为添加回收实验样，经试验该试样中不含这4种违禁药物。

表 6 可邦男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率
图18 可邦男性抗衰老片提取离子叠加色谱图
图19 可邦男性抗衰老片添加1 mg/kg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图20 可邦男性抗衰老片添加5 mg/kg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图21 可邦男性抗衰老片添加10 mg/kg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
6.3 营养胶囊室内回收率实验数据
表 7 营养胶囊育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果
7、实验室间精密度数据
按照GB/T 6379.2-2004 实验室间协同实验的要求，本方法在厦门局、深圳局等5 个实验室进行了协同实验，采用不含有育亨宾、伐地那非、西地那非和他达那非的实际样品分别作3个水平的添加实验，结果见表7、表8。

表7 片剂样品实验室间精密度数据
表 8 口服液样品实验室间精密度数据
以上实验数据表明，本方法实验室内、实验室间的各项技术指标满足国标要求。

方法简便易操作，实用性强。

可以满足保健食品中是否加有育亨宾、伐地那非、西地那非和他达那非的准确定性定量分析。

8、采用本标准对市场样品抽查结果
从市场抽样看，26个样本中只有5个样本没有加育亨宾等4种药物，仅占19.2%。

伐地那非使用最多，占38.5%；西地那非次之，占34.6%；他达那非占7.7%；育亨宾
占3.8%。

而育亨宾作为一种新型壮阳药物，国内还未建立过检测方法，也未见过对
这种药物使用情况的调查，这次我们意外发现“龟鹿海狗”保健品中含有该成
分，说明市场已开始使用。

参考文献
[1] Yingwu Wang, Jiang Wang, Yimin Cui, J. Paul Fawcett, Jingkai Gu. Liaquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for the quantitation of sildenafil in humnan plasma; Journal of chromatography B;
828(2005)118-121
[2] A. Abd-Elbary, N. H. Foda, O. N. El-Gazayerly; Stability indicating high performance liquid chromatographic assay for the determination of sildenafil citrate in bulk and in formulations ; Chromatographia,2004,59(No.9/10),561-566
[3] J. J. Berzas Nevado, M. J. Vlllasenor Llerena, A. M. Contento Salcedo, Juana Rodriguez Flores ; Development of
a capillary gas chromatographic method with flame ionisation detection for the simultaneous determination of sildenafil and its N-demethylated metabolite in biological fluids; J. Sep. Sci,2002,25,767-772
[4] Joo Youn Cho, Hyeong Seok Lim, Kyung Sang Yu, Hyun Joo Shim, In Jin Jang, Sang Goo Shin . Sensitive liquid chromatography assay with ultraviolet deterion for a new phosphodiesterase V inhibitor, DA-8159, in human plasma and urine ; Journal of Chromatography B,795(2003) 179-186
[5] Eiichi Mikami, Tsutomu Ohno,Hiroshi Matsumoto; Simulataneous identification/determination system for phentolamine and sildenafil as adulterants in soft drinks advertising roborant nutrition; Forensic Science International 130(2002)140-146
[6] Qionglin Liang, Jun Qu, Guoan Luo, Yiming Wang; Rapid and reliable determination of illegal adulterant in herbal medicines and dietary supplemenys by LC/MS/MS; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40(2006) 305-311
[7] Maciej J. Bogusz, Huda Hassan, Eid Al-Enazi, Zuhour Ibrahim, Mohammed Al-Tufail. Application of LC-ESI-MS-MS for detection of synthetic adulterants in herbal remedies; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41(2006) 554-564
[8]张朝辉，康绍英，许敏洁，马铭，陈波，姚守拙液-液-液微萃取/高效液相色谱法测人血浆中的西地那非和伐地那非 [刊]色谱 2005年7月第23卷第4 期 358-361
[9]陈稚，肖松，陈波，姚守拙，王竹天，扬大进，韩宏伟高效液相色谱/质谱联用测定保健食品中的伐地那非 [刊]中国食品卫生杂志 2005年第17卷第6 期 508-511
[10] 徐远金，许桂苹高效液相色谱-质谱法测定保健品中脱水吗啡、西地那非、前列地尔 [刊]色谱 2005 年11 月第23 卷第6 期 633-635。