水稻品种DNA指纹检测及其应用
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
注：退火温度对扩增产物的影响？
3、琼脂糖凝胶电泳
1）制胶：用1×TAE液配制4%琼脂糖凝胶70 ml+10 ul GoldViewer 2）点样：每管加入2ul溴酚兰加样缓冲液，瞬时离心。
取10ul 扩增产物点样 (请注意点样顺序)
3）电泳：稳压（100V），电泳1.5h 4）观察：紫外灯下观察电泳结果
4、实验结果分析 多态性标记的筛选
6个多态性标记构建的水稻品种SSR指纹图谱
RM587 RM264 RM278 RM228 RM202 RM17
红莲优6号A
A
A
A
A
A
两优培九 B
B
A
A
A
B
P1 A
B
A
A
B
B
P2 A
A
B
B
B
A
P3 AB AB AB AB AB AB
P4 A
AB A
A
AB AB
请利用不同品种的SSR指纹图谱判断P5、P6杂交种的亲本来源
1、ddH2O 2、10×buffer
10*72=720 ul 2.0*72=144 ul
1500 ul 180 ul
3、25mM MgCl2 4、10mM dNTPs
1.8*72=130 ul 1.0*72=72 ul
150 ul 100 ul
5、10uM primer
2.0*12*6=24 ul*6 30 ul*6 (每对正反引物混合)
1、ddH2O
10.0
2、10×buff
2.0
90.0 18.0
3、25mM MgCl2
1.8
16.2
4、10mM dNTPs 1.0
9.0
5、5uM primer
2.0
18.0
6、5 U/ul Taq 酶 0.2
1.8 (分装前先离心)
7、DNA模板
3.0
每个标记分别在1个0.5 ml离心管中配制反应混合液
面优越性）
3、DNA指纹图谱（条码技术）能有效鉴别不同生物物种或同一物种
的不同基因型。
4、 常用的几种DNA分子标记：
1）RFLP 2）AFLP 3）RAPD
5）SCAR：sequence characterized amplified region 6）CAPS ：cleaved amplified polymorphic sequence 7）InDel
水稻品种SSR指纹图谱及其应用
实验目的
ห้องสมุดไป่ตู้学习SSR指纹图谱的构建原理与方法 应用SSR指纹图谱进行水稻品种的鉴别
实验原理
1、生物具有丰富的遗传多样性，并在个体形态上表现出千姿百态。
2、DNA分子标记技术的发展，使得在DNA分子水平揭示生物的遗传
多样性成为可能。（稳定性好、不受环境和发育时期限制等多方
应用SSR指纹图谱鉴定杂交稻真假杂种的实例
SSR标记RM 17 对杂交稻“两优培九”100 粒单种子的扩增结果
(M分子量Marker，A不育系，R恢复系，2轮点样）
Ref：彭锁堂、庄杰云、颜启传、郑康乐. 我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR 标记和纯度鉴 定.中国水稻科学, 2003,17(1): 1～5
实验材料
1、 2个杂交稻品种及其4个亲本品种 1）红莲优6号（粤泰A/扬稻6号） 2）两优培九（培矮64S/93-11） 3） P1 4） P2 5） P3
Chr. Chr.1 Chr.2 Chr.7 Chr.2 Chr.7 Chr.2
标记 RM212 RM263 RM505 RM525 RM234 RM202
特别提示 实验报告务必有图片
PCR试剂准备
1、每3个小组（12人）共用1套试剂（实际反应数36个） （PCR试剂各提供72个反应需用量，6对引物各提供12个反应需用量）
2、4个班合计173人，共提供16套PCR试剂 3、每套PCR试剂提供量（见下表）
PCR试剂
72个反应需用量 每套试剂实际提供量
6、5 U/ul Taq 酶
0.2*72=14.4 ul
25 ul
标记编号 标记1 标记2 标记3 标记4 标记5 标记6
6） P4
2、 6个 SSR标记（见右表）
3、分组：1）4人一组，用2个标记分别对6个水稻品种进行PCR扩增
2）每3个小组的实验结果整合到一起，用于实验报告的撰写
实验方法
1、PCR反应体系配制：在0.5 ml离心管中配制反应混合液
反应因子
单个反应体积（µl） 9个反应用量（µl）
P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1A 2B A3B 2B3AB 1A …………
标记等位基因的识别与标识
RM522 单态性标记
AB C
RM552 多态性
ABDC
RM267 多态性
表1 不同基因型SSR指纹图谱示例
4） SSR
SSR分子标记的原理：
SSR序列特征： 如：————(AG)n————
(AG)n, n=36
(AG)n, n=75
(AG)n, n=112
SSR的 PCR扩增及电泳检测
一般为共显性，在F2群体中，理论上[A]：[AB]：[B] = 1：2：1
Parents
F2 individuals
标记
基 因
… M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9
型
P1 A B B A B C A B F
P2 C B A A D D B A C
P3 B B A D C F E B A
P4 E B A D C B B A B
影响指纹图谱特异性的主要因素： 1、生物内在的遗传多样性 2、标记的多态性 3、标记的数目
1) 先按9个反应所需量配制因子1-6的混合液，瞬时离心混匀 2) 将混合液分装到6个反应管中，每管17 µl 3) 向每管分别添加6个水稻品种的DNA模板， 4) 再向每管各加1小滴矿物油，瞬时离心 5) 按标记（每标记1列）将反应管安放到PCR仪上
2、PCR扩增程序
① 94℃ 预变性 5min ② 94℃ 变性 1min ③ 55℃ 退火 1min ④ 72℃ 延伸 1min ⑤ 重复步骤② - ④ 35次 ⑥ 72℃ 延伸 10min
3、琼脂糖凝胶电泳
1）制胶：用1×TAE液配制4%琼脂糖凝胶70 ml+10 ul GoldViewer 2）点样：每管加入2ul溴酚兰加样缓冲液，瞬时离心。
取10ul 扩增产物点样 (请注意点样顺序)
3）电泳：稳压（100V），电泳1.5h 4）观察：紫外灯下观察电泳结果
4、实验结果分析 多态性标记的筛选
6个多态性标记构建的水稻品种SSR指纹图谱
RM587 RM264 RM278 RM228 RM202 RM17
红莲优6号A
A
A
A
A
A
两优培九 B
B
A
A
A
B
P1 A
B
A
A
B
B
P2 A
A
B
B
B
A
P3 AB AB AB AB AB AB
P4 A
AB A
A
AB AB
请利用不同品种的SSR指纹图谱判断P5、P6杂交种的亲本来源
1、ddH2O 2、10×buffer
10*72=720 ul 2.0*72=144 ul
1500 ul 180 ul
3、25mM MgCl2 4、10mM dNTPs
1.8*72=130 ul 1.0*72=72 ul
150 ul 100 ul
5、10uM primer
2.0*12*6=24 ul*6 30 ul*6 (每对正反引物混合)
1、ddH2O
10.0
2、10×buff
2.0
90.0 18.0
3、25mM MgCl2
1.8
16.2
4、10mM dNTPs 1.0
9.0
5、5uM primer
2.0
18.0
6、5 U/ul Taq 酶 0.2
1.8 (分装前先离心)
7、DNA模板
3.0
每个标记分别在1个0.5 ml离心管中配制反应混合液
面优越性）
3、DNA指纹图谱（条码技术）能有效鉴别不同生物物种或同一物种
的不同基因型。
4、 常用的几种DNA分子标记：
1）RFLP 2）AFLP 3）RAPD
5）SCAR：sequence characterized amplified region 6）CAPS ：cleaved amplified polymorphic sequence 7）InDel
水稻品种SSR指纹图谱及其应用
实验目的
ห้องสมุดไป่ตู้学习SSR指纹图谱的构建原理与方法 应用SSR指纹图谱进行水稻品种的鉴别
实验原理
1、生物具有丰富的遗传多样性，并在个体形态上表现出千姿百态。
2、DNA分子标记技术的发展，使得在DNA分子水平揭示生物的遗传
多样性成为可能。（稳定性好、不受环境和发育时期限制等多方
应用SSR指纹图谱鉴定杂交稻真假杂种的实例
SSR标记RM 17 对杂交稻“两优培九”100 粒单种子的扩增结果
(M分子量Marker，A不育系，R恢复系，2轮点样）
Ref：彭锁堂、庄杰云、颜启传、郑康乐. 我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR 标记和纯度鉴 定.中国水稻科学, 2003,17(1): 1～5
实验材料
1、 2个杂交稻品种及其4个亲本品种 1）红莲优6号（粤泰A/扬稻6号） 2）两优培九（培矮64S/93-11） 3） P1 4） P2 5） P3
Chr. Chr.1 Chr.2 Chr.7 Chr.2 Chr.7 Chr.2
标记 RM212 RM263 RM505 RM525 RM234 RM202
特别提示 实验报告务必有图片
PCR试剂准备
1、每3个小组（12人）共用1套试剂（实际反应数36个） （PCR试剂各提供72个反应需用量，6对引物各提供12个反应需用量）
2、4个班合计173人，共提供16套PCR试剂 3、每套PCR试剂提供量（见下表）
PCR试剂
72个反应需用量 每套试剂实际提供量
6、5 U/ul Taq 酶
0.2*72=14.4 ul
25 ul
标记编号 标记1 标记2 标记3 标记4 标记5 标记6
6） P4
2、 6个 SSR标记（见右表）
3、分组：1）4人一组，用2个标记分别对6个水稻品种进行PCR扩增
2）每3个小组的实验结果整合到一起，用于实验报告的撰写
实验方法
1、PCR反应体系配制：在0.5 ml离心管中配制反应混合液
反应因子
单个反应体积（µl） 9个反应用量（µl）
P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1A 2B A3B 2B3AB 1A …………
标记等位基因的识别与标识
RM522 单态性标记
AB C
RM552 多态性
ABDC
RM267 多态性
表1 不同基因型SSR指纹图谱示例
4） SSR
SSR分子标记的原理：
SSR序列特征： 如：————(AG)n————
(AG)n, n=36
(AG)n, n=75
(AG)n, n=112
SSR的 PCR扩增及电泳检测
一般为共显性，在F2群体中，理论上[A]：[AB]：[B] = 1：2：1
Parents
F2 individuals
标记
基 因
… M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9
型
P1 A B B A B C A B F
P2 C B A A D D B A C
P3 B B A D C F E B A
P4 E B A D C B B A B
影响指纹图谱特异性的主要因素： 1、生物内在的遗传多样性 2、标记的多态性 3、标记的数目
1) 先按9个反应所需量配制因子1-6的混合液，瞬时离心混匀 2) 将混合液分装到6个反应管中，每管17 µl 3) 向每管分别添加6个水稻品种的DNA模板， 4) 再向每管各加1小滴矿物油，瞬时离心 5) 按标记（每标记1列）将反应管安放到PCR仪上
2、PCR扩增程序
① 94℃ 预变性 5min ② 94℃ 变性 1min ③ 55℃ 退火 1min ④ 72℃ 延伸 1min ⑤ 重复步骤② - ④ 35次 ⑥ 72℃ 延伸 10min