华东理工大学本科生微生物学基础实验讲义

第一部分基础实验实验一显微镜的使用和微生物的形态观察一、实验目的1. 熟悉显微镜的使用，尤其是油镜的使用2. 熟悉几种常用微生物的个体形态3. 熟悉典型微生物的菌落形态并加以区分二、实验原理1. 显微镜的使用单个微生物是肉眼观察不到的，即使用高倍镜大多数细菌仍观察不清，故需用油镜观察。

在用油镜观察时，必须将油镜头浸入香柏油中。

香柏油的折光率为1.51-1.52，与玻璃片的折光率1.52相近，因此在物镜（玻璃）与标本片（玻璃）之间加入香柏油可避免光线从一个介质（玻璃）进入到另一折光率不同的介质（空气）而引起的散射。

2. 微生物的形态微生物种类繁多，根据它们的主要形态分为细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群。

微生物个体微小，要识别它们，一是借助于显微镜观察其个体形态，二是直接用肉眼观察其菌落形态(群体形态)。

细菌的个体形态一般有球状、杆状和螺旋状三种，放线菌是丝状菌，菌丝分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝，孢子丝形态有螺旋状和分枝状两种，霉菌也是丝状菌，但个体较大，有的有假根、足细胞、青霉穗等，酵母菌则一般呈椭圆形，有些在特殊条件下能形成假丝。

菌落是由某一微生物的单个细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后形成的肉眼可见的集落。

菌落形态在一定程度上是个体细胞形态结构在群体上的反映。

每一类微生物都有其各自的细胞形态，因而其菌落形态也各异。

观察微生物菌落，首先要区别细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群的菌落。

细菌的菌落多生于培养基的表面，较小、光滑或粗糙、干燥或湿润，多具臭味，易被挑起。

霉菌菌丝分枝很多，相互交错形成菌丝体，其表面形成孢子层，菌落大多数呈绒毛状或棉絮状，不易被挑起，多具霉味。

放线菌菌丝形状与霉菌相似，因存在基内菌丝，故和霉菌一样与培养基结合牢固，不易被挑起，菌落较小，表面呈紧密的线状或粉状。

不少放线菌具特殊的土腥味。

酵母菌的菌落类似于细菌，因无菌丝组织而易被挑起，但菌落一般比细菌大、厚且透明度较差，乳白色，有酒香味。

三、普通光学显徽镜的构造1.光学显微镜的结构由一组光学放大系统、调节系统及机械支持组成(图1-1)。

①机械系统部件显微镜的机械部件，是安装光学放大系统的基座。

它包括镜座、载物台、物镜转换器、镜筒和调节器等。

镜座镜座是显微镜的基本支架，由底座和镜臂两部分组成。

载物台即镜台其上放置被观察标本。

用低倍镜观察样品(如平皿上的菌落)，用手移动样品就行了，如用高倍镜或油镜观察时，则用载物台上的压片夹（或十字推进器）固定。

粗、细调节旋钮粗、细调节旋钮是用来调节镜筒或载物台使其上下移动，以达到调焦、使标本观察清晰目的的装置。

物镜转换器其上可配4—6个物镜。

因观察样品时，需从低倍镜转至高倍镜再转至油镜。

因此，在物镜转换器上安装有一套不同放大倍数的物镜，以便选择使用。

镜筒物镜的放大率是对一定的镜简长度而言的。

镜筒长度的变化，放大率将随之变化，成像质量也有影响。

因此，显微镜筒长国际上有标准，定为160mm。

②光学放大系统部件光学显微镜的光学系统包括反光镜、聚光器、物镜和目镜等反光镜是取光设备，它有二个面，一是平面镜，另一面是凹面镜，反光镜安装在弧弓上，可自由翻转调整位置，使光线射向聚光器。

聚光器安装在载物台下，其作用是将经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，使物象获得明亮清晰的效果。

聚光器的高度可以调节，以达到最佳亮度。

聚光器上还装有孔径光阑，可通过调节光阑，与聚光器配合使光线达到最佳。

物镜安装在物镜转换器上的透镜。

利用光线使被观察物体第一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量。

低倍物镜10×高倍物镜40×油浸物镜100×目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并使物像映入观察者的眼中。

目镜5×；10×；15×四、实验材料1.普通光学显微镜，擦镜纸，香柏油，二甲苯，接种环，接种针2.各类微生物标本(1)球菌：四联球菌(Micrococcus tetragenus)藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(2)杆菌：大肠杆菌(Escherillus coli)枯草杆菌(Bacillus subtilis)(3)真菌：酵母菌（Saccharomyces cerevisae）3.微生物菌落平板(1)细菌：四联球菌、大肠杆菌和枯草杆菌混合液(2)放线菌：链霉菌5406(S. jingyangensis)链霉菌属各类代表种平皿培养物(3)霉菌：毛霉(Mucor)、青霉(Peniciellium)、曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)(4)酵母菌：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)(5)噬菌体：林肯链霉菌噬菌斑五、实验步骤（一）显微镜的使用1.显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬到实验桌上。

2.调节光源可利用灯光或自然光，，并通过反光镜，聚光器和光阑调节光线，使视野的光线最佳。

3.将标本片置于载物台上并用标本夹夹住，注意正面向上。

4.低倍镜观察由于低倍镜视野较大，易发现目标，故观察标本需先用低倍镜观察。

将低倍镜旋至镜筒下，调节粗调节器，使物镜降至距标本片5mm左右，由目镜观察慢慢向上旋转粗调节器，直至发现视野中的物象，然后再用细调节器调至物象清晰为止。

将物象移到视野中央，转至高倍镜观察。

5.高倍镜观察将低倍镜转换为高倍物镜。

在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。

然后从目镜观察，调整光亮适度，缓慢调节细调节旋钮，至物像清晰为止，并移至视野中心准备用油镜观察。

6.油镜观察将高倍镜转换为油镜。

在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油，从侧面观察，镜筒缓慢地下降，使油浸物镜浸入香柏油中。

从目镜内观察，通过调节光阑，聚光器，使光线达到最强。

用粗调节旋钮将镜筒慢慢上升(此时绝不能将镜筒下降)，当出现物像后再用细调节调至最清晰为止。

7.观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜偏位，并用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头上残留油迹。

将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜成八字形，再下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜对号放于显微镜箱中。

（二）微生物形态观察1.用显微镜油镜观察球菌和杆菌的个体形态标本片。

2.观察细菌、放线菌、霉菌和酵母菌在固体培养基上形成的菌落形态以及噬菌体所形成的负菌落（噬菌斑）。

注意菌的大小、颜色、气味，表面有无光泽，是否光滑透明、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况，菌落边缘是否整齐。

观察酵母菌与细菌菌落有无区别，用接种环挑一下菌落是否容易挑起。

观察丝状微生物的菌落是疏松的棉絮状或绒毛状，还是比较紧密的粉状，菌落表面与背面颜色是否相同，有无水溶性或脂溶性色素，菌落是否易被挑起。

对于噬菌体应注意空斑大小及形态。

3.示教观察(1)细菌的个体形态：逗号弧菌(Vibrio comma)(2)杀螟杆菌(Bacillus thuringiensis)不同阶段的个体形态：营养体、孢子囊、芽胞。

(3)细菌的特殊结构：杀螟杆菌的芽胞，自身固氮菌(Azotobacter)的荚膜，变形杆菌(Proteus vulgaris)的鞭毛。

(4)放线菌的形态观察：孢子丝和孢子形态观察，沉浸培养下菌丝形态的观察(5)酵母菌个体形态的观察：啤酒酵母(6)霉菌个体形态的观察：青霉、曲霉、根霉、毛霉菌丝，分生孢子、子囊孢子六、注意事项1.香柏油不能过多，只需一小滴。

2.香柏油从瓶中取出时，切勿搅动，滴上玻璃片时也不要涂抹，以免形成气泡。

3.使用油镜时尽量将聚光器向上，光阑放大。

4.用油镜时假如一再看不清物象，可验看油中是否存在气泡，可将镜头及标本片上的油擦去，重新滴加，以消除气泡。

七、实验记录1. 绘图表示各类微生物的个体形态。

2. 列表说明各类微生物菌落特征。

八、思考题1. 油镜使用时为何一定要浸在香柏油中？2. 在使用油镜时应怎样控制聚光器和光阑？3. 如何区别微生物四大类群的个体形态及菌落特征？实验二培养基的制备和灭菌一、实验目的1. 了解培养基的配制过程2. 熟悉培养基灭菌过程，并了解其它灭菌过程二、实验原理培养基是人工提供的微生物在实验室的生活环境和场所。

自然界中，微生物种类繁多, 营养类型不同，对营养的要求也各不相同。

但均应含有满足微生物生长发育所需的水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子以及某些特需的微量元素等。

此外培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及适宜的渗透压。

培养基主要用于分离、培养、保存和鉴定微生物。

培养基的种类很多，有专门培养放线菌的高氏培养基，用于培养霉菌的蔡氏（Czapek）培养基，用于培养细菌的蛋白胨牛肉浸液（L.B.）培养基等。

根据培养基的物理状态的不同，又分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。

固体培养基琼脂加量为1.5-2.5%，半固体培养基琼脂加量为0.4-1.0%，液体培养基则不需要加琼脂。

三、实验材料1.培养基成份：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂等。

2.试剂：1N NaOH溶液，1N HCl溶液3.仪器及玻璃器皿：pH试纸（6.4-8.0）, 三角烧瓶，试管，烧杯，搅棒，量筒，纱布，漏斗，台秤，吸管，药匙，棉塞，铜丝筐，棉线，牛皮纸，高压蒸汽灭菌锅。

四、实验步骤培养基配制的一般步骤为：原料的称量—→溶解—→调节pH—→过滤澄清—→分装—→塞棉塞和包扎—→灭菌。

1．原料称量：根据培养基配方，由计料体积计算出各种原料的所需用量，然后准确称取各种原料成分。

2. 溶解：一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加少于计料体积的水进行加热溶解，但如有磷酸盐和钙盐等混合在一起时易产生磷酸钙和磷酸镁沉淀，所以要分别溶解。

加热溶解时要不断搅拌，待药品完全溶解后，补足水分至计料体积。

配制固体培养基时，预先将琼脂称好用剪刀剪成小段，以便溶化，然后将液体培养基煮沸，把琼脂放人，继续加热至琼脂完全融化。

注意在加热过程中应注意不断搅拌，以防琼脂沉淀糊底烧焦，待琼脂完全融化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。

3.调节pH值：液体培养基配好后，一般要调节至所需的pH值。

在调pH前先用pH试纸测一下培养基的原始pH。

常用盐酸和氢氧化钠溶液进行调节，用精密pH试纸进行测定。

固体培养基酸碱度的调整，与液体培养基同，一般在加入琼脂前进行。

4.过滤和澄清：如有特殊要求用滤纸或四层纱布过滤。

5.分装：培养基配好之后，要根据不同的使用目的，分装到各种不同的容器中。

（图4-1）a.试管斜面分装在15×150mm试管中加入约3ml培养基，加上棉花塞后灭菌，然后在未凝固前将试管搁在玻棒或木条上即可。

搁置的斜面要适当，一般不超过试管长度的二分之一。