蛋白质磷酸化

蛋白磷酸化水平的检测
1. Western blot 2. [32 P]放射性标记法 3. 磷酸化蛋白质的荧光染料 Pro2Q Diamond 4. 液相色谱法
GSK-3
糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一种丝 ／苏氨酸蛋白激酶，其广泛存在于各 种细胞中，参与多种信号转导通路调 节，在胚胎发育、细胞分化、肿瘤形 成等多方面发挥重要作用。
根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可 分为三大类： • （1）为丝氨酸/苏氨酸型。这类蛋白激酶使底物蛋 白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化； • （2）为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸残基； • （3）是双重底物特异性蛋白激酶（dual-specificity protein kinase），既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸 化又可使酪氨酸残基磷酸化。
PKC的作用
对糖代谢的控制
在肝细胞中， 蛋白激酶C 与蛋白 激酶A 协作磷酸化糖原合成酶， 抑制葡萄糖聚合酶（glucosepolymerizing enzyme）的活性， 促进糖原代谢。
PKC的作用——参与基因表达调控
PKC可通过两种途径参与基因表达的控制。一种途径是蛋白激酶激活一个 磷酸化的级联系统，使MAP蛋白激酶磷酸化，进而将基因调节蛋白Elk-1 磷酸化，使之激活。激活的Elk-1与血清反应元件（SRE）和血清反应因 子（SRF）结合共同调节基因表达。另一种途径是蛋白激酶磷酸化并激活 抑制蛋白Iκ-B，释放基因调节蛋白NF-κB，使之进入细胞核激活特定基因 的转录。
CAM激酶
钙调蛋白激酶（CaM-kinase） 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶。一 个钙调蛋白可以结合4个Ca2+。 Ca2+同钙调蛋白结合形成钙-钙 调蛋白复合物（calciumcalmodulin complex），就会 引起钙调蛋白构型的变化，增强
了钙调蛋白与许多效应物结合的 亲和力。
在不同的细胞中，Ca2+-钙调蛋 白复合物可以同CaM-蛋白激酶、 cAMP磷酸二酯酶、以及质膜中 的Ca2+运输蛋白结合， 将它们 激活，进行信号的放大。
1. PKA全酶由4个亚基组成(R2C2）包括两个相同的调节亚基（R）和两 个相同的催化亚基（C）。 2. C亚基具有催化活性，R亚基具有调节功能，有两个cAMP结合位点。 R亚基对C亚基具有抑制作用，所以，R和C聚合后的全酶（R2C2）无催 化活性。R亚基与cAMP的结合导致C亚基解离并表现出催化活性。
• (2)蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的 酶"活性"。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能 对外界刺激做出更迅速的反应。 (3)对外界信号具有级联放大作用； (4)蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信 号的持续反应。
• 被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨 酸。
蛋白激酶的种类
蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上 γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。
蛋白质磷酸化的作用
• (1) 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信 号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如 cAMP，Ca2+，DAG（二酰甘油，diacyl glycerol） 等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞 内代谢产物的影响。
激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合 成并活化A激酶，再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激 酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供 ATP。
C激酶与PIP2、IP3和DAG
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是G蛋白偶联受体系统中的效应 物，在非活性状态下是水溶性的，蛋白激酶C的激活是脂依赖性的， 需要膜脂DAG 的存在，同时又是Ca2+依赖性的，当DAG在质膜中出 现时，胞质溶胶中的蛋白激酶C 被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用 下被激活。
根据是否有调节物来分又可分成两大类
信使依赖性蛋白质激酶 cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA） cGMP依赖性蛋白激酶（PKA）
非信使依赖型蛋白激酶 酪蛋白激酶（CKⅠ，Ⅱ）
组蛋白激酶
Ca2+、CaM 依赖性蛋白激酶 糖原合成酶激酶（GSK）
视紫红质蛋白激酶
肾上腺素β受体蛋白激酶
受CAMP调控的A激酶
酪氨酸蛋白激酶
蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）是一类催化ATP上γ-磷酸转 移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在 细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。具有受体功能的酪氨酸蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体结合 区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。
PI3K/Akt/GSK-3β 可以调控神经细胞 的生长和发育，GSK-3抑制剂则被看 作是糖尿病和阿尔茨海默氏症的可能 治疗药物。
实验设计
细胞裂解
免疫沉淀 p-AKT
GSK-3β 蛋白 的荧光标记
GSK-3β与p-AKT 激酶反应
Elution buffer洗 脱p-GSK-3β蛋白
WB检测p-GSK3β 的量
MAP激酶
MAP激酶（mitogen-activated protein）是存在于真核生物中的 丝氨酸/苏氨酸激酶，是传递外界 刺激的信号分子之一。MAPK的 活化经历了以下的级联反应： MAP3K—MAP2K—MAPK—转录 因子激活。与细胞增殖、分化、 基因表达、凋亡等相关。
哺乳动物分为4个 MAPK 家族分子 ：ERK1/2、ERK5 、JNK、P38。
百度文库
MST 检测
结果
GSK-3β 蛋白与phosphoGSK-3β 的western 检测。
GSK-3β 蛋白与phospho-GSK-3β 的热泳迁移率 曲线图。GSK-3β 和p-GSK-3β 按1:2, 1:4, 1:8 稀释，在20, 40, 80%激发能量的热迁移率比较。
下一步工作
通过MST实验，比较磷酸化与非磷酸化的GSK-3β 与 AKT 之间的亲和力大小。
蛋白质磷酸化在生物学 中的作用
张严 2019-1-15
1. 定义 2. 分类 3. 功能 4. 检测方法 5. 实验方案设计及结果
定义
定义：蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程，是生物体内 存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占 有极其重要的地位。逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的， 称为蛋白质脱磷酸化。
谢谢！
在有无ATP 的情况下，比较GSK-3β 与AKT 之间的亲 和力的大小。 实验分组： ①荧光标记的P-GSK-3β 与不同浓度的P-AKT ②荧光标记的GSK-3β 与不同浓度的P-AKT ③荧光标记的P-AKT 与不同浓度的GSK-3β ④加入ATP，荧光标记的GSK-3β 与不同浓度的P-AKT