第二章 基因工程的酶学

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EcoRⅠ
PstⅠ
三、位点偏爱（Site preference）
某些限制酶对同一介质中的有些位点表 现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识 别序列表现出不同的切割效率的现象称作位 点偏爱。
某些噬菌体 DNA 中的某些相同的酶切 位点对酶的敏感性是不同的。如：
GAATCG, AAATTT, GATATC, ACGGCA? 为什么？
（1）识别位点 4—8bp，回文结构
（2） 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体 衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的 形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG
（3）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’CTGCAG GACGTC -3’ -5’
5’3’-
CTGCA G G ACGTC
-3’ -5’
（5）粘性末端的意义
①连接便利
只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
② 5’末端标记，3’末端加尾
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶 进行32P标记。
Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 Xma I Sma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（7）同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 BamH I Bgl Ⅱ Bcl I Xho Ⅱ 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新 位点一般不能再被原来的酶识别。 BamH I 5’-G 3’-CCTAG GATCT-3’ A-5’
？
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
一、限制性内切酶的基本特性 思考题
1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的II 类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可 能是什么？
是一类能够识别双链DNA分子中的某 2、下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能 种特定核苷酸序列，并由此处切割 DNA 双 是II类限制性内切核酸酶的识别序列： 链的核酸内切酶。
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产ห้องสมุดไป่ตู้ ？末端
产生？末端
（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’3’5’3’GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G -3’ -5’ -3’ -5’
λ噬菌体DNA为48502bp，含12bp粘端。 EcoRⅠ酶切割噬菌体中的5个位点时并不 是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位 点切割快10倍；
四、在实验室条件下进行酶切
20 微 升 反 应 体 系
五、酶切反应条件
缓冲液 反应温度
反应时间 终止酶切的方法
缓冲液(Buffer)
（1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。 酶 最适温 酶 度 oC 30 50 50 65 最适 温度 oC Apy I 30 BstE II 60 Mae III 55 酶 最适 温度 oC Ban I 50 Mae I 45 Sma I 25
表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）
待测的寡核苷酸序列 限制酶 待测的寡核苷酸序列
2hr
AccⅠ CCGGTCGACCGG 0
20hr
0
HindⅢ
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG GGAATTCC
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAG（N）14 CTGCAG（N）20
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
（6）同裂酶（Isoschizomers)
识别位点的序列相同的限制性内切酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Review
模板序列
第二章 基因工程的酶学基础
Enzymes
(II类)限制性内切酶
限制性内切酶在基因 工程操作中有哪些具 体用途？
限制性内切酶的存 在给没给基因工程 操作带来麻烦？
(II类)限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970 年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ
Bgl Ⅱ
Sau 3A
二、DNA末端长度对限制酶切割的影响
限制酶切割 DNA 时对识别序列两端 的非识别序列有长度的要求，也就是说在 识别序列两端必须有一定数量的核苷酸， 否则限制酶将难以发挥切割活性。
温馨提示——Be careful 在设计 PCR 引物时，如果要在末端引 入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩 增的 PCR 产物，应在设计的引物末端加上 能够满足要求的碱基数目。另外，了解末 端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多 克隆位点时选择酶切秩序。