用PCR进行差异克隆Displayingdifferences

contents
1 重组体向寄主细胞的导入 2 重组体克隆的筛选与鉴定
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第6章 基因的转移与重组体的检测
1 重组体向寄主细胞的导入
1 .1重组体向大肠杆菌的转移
• 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分 遗传性状的现象。 • 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种 后代。 • 首次发现转化现象——肺炎链球菌
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第6章 基因的转移与重组体的检测
不同的载体，须选用合适的宿主
• pUC系列的克隆载体，可用大肠杆菌DH5α
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第6章 基因的转移与重组体的检测
大肠杆菌的转化方法
Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法
电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌
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第6章 基因的转移与重组体的检测
1.1.1 Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法：
挑取单菌落，于含相应抗生素 的液态培养基培养后，取一定 量提取质粒，进行鉴定（酶切、 杂交、测序等）
↑
→
取30～50ul，涂布在含相 应抗生素的培养基上，平 板培养
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第6章 基因的转移与重组体的检测
CaCl2 的诱导原因：
• 在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca 2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜 与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态
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第6章 基因的转移与重组体的检测
制备感受态细胞的注意事项
1. 细胞生长状态和密度:
• 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或 -20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌 液。 • 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养 液的OD600 来控制。DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度 在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较 合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
第6章 基因的转移与重组体的检测
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第6章 基因的转移与重组体的检测
basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤
1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步
骤，分离出带有目的基因的DNA片段。
2.重组载体的制备：将目的基因的DNA片段插入到能自我复制并带有选择性
标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNA重组过程，需要内切酶、 连接酶等的参与）
3.重组载体的转化：将重组体（载体）
4.重组克隆的
转入适当的受体细胞中。
筛选鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
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5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我源自文库所需要的基因产物
第6章 基因的转移与重组体的检测
先制备感受态细胞（处于最容易吸收外源DNA的状态 ，再用低温/高温刺激，使之吸收外源DNA，然后涂 平板，筛选之。具体步骤参P149。
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第6章 基因的转移与重组体的检测
感受态（competence）
感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现 转化的一种生理状态。是细菌的一种遗传特性， 而且也受生长阶段、培养条件的影响。 不同物种，制备感受态细胞的最适时期也不一样。
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* 重组载体（连接产物）转化到感受态细胞中
2ul重组DNA ＋ 50ul感受态细胞混匀
第6章 基因的转移与重组体的检测
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冰浴30min
不同公司生产的感受态细胞，所 需的冰浴时间、热激时间都会有 不同的要求。有些热激时间只要 求30s或45s。
↓ ↓
↓
42℃热激90～120S
冰浴2min 复苏：加入450ul液态LB培养基，37 ℃轻缓振荡培养（150rpm），1.5～2h
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第6章 基因的转移与重组体的检测
2. 质粒的质量和浓度:
• 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 • 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使50μ l 的感受态细胞达到饱和。一般 情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
肺炎链球菌： 芽孢杆菌属： 大肠杆菌： 对数生长后期 指数期末和稳定期 刚进入对数期
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右
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第6章 基因的转移与重组体的检测
感受态细胞的制备
1. 挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养 基中，37℃振荡培养过夜 2. 按1％的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振 荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状) 3. 倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干 4. 加入1mL 预冷的无菌0.1mol·L-1 CaCl2溶液涡旋，4℃ 下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清 5. 沉淀以50-100μ L 预冷的0.1mol·L-1 CaCl2重悬，4℃ 保存备用，7d内可用。
3. 试剂的质量:
• 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)， 并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
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第6章 基因的转移与重组体的检测
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：
• 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心 管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂 都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、 鉴定带来不必要的麻烦。
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0℃时，Ca 2＋ 能与加入的DNA分子结合，形成抗 DNase的羟基－磷酸钙复合物，吸附在胞膜的外表面 ；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出 现间隙，细胞吸收外源DNA。
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第6章 基因的转移与重组体的检测
1.1.2 电穿孔转化法
基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进 行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效 吸收。 影响因素： 电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度 菌体制备 冷却，离心，洗涤（降低离子强度） 10％甘油重悬细胞，-70 ℃贮存 低温下（0－4 ℃）进行电穿孔转化