高频电刺激下丘脑后核后大鼠僵直和运动能力变化

前言

帕金森病〔Parkinson's disease, PD〕是一种中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，以震颤、僵直、运动缓慢和姿势平衡障碍为主要特征。脑深部刺激〔deep brain stimulation, DBS〕被认为是目前治疗帕金森病的最正确方法，根据不同的病症选择相应地靶点，其中常用的刺激靶点有丘脑底核〔subthalamic nu-cleus, STN〕，苍白球内侧部〔globus pallidus internal, GPi〕和丘脑腹中间核〔Vim〕。然而，这些靶点对于帕金森病的运动不能〔akinesia〕均效果欠佳。下丘脑后核〔posterior hypothalamicnucleus, PH〕与运动皮层、丘脑、小脑、间脑以及脊髓存在广泛的纤维联系，在行为的组织过程中具有重要作用。有实验说明损毁下丘脑后核可导致动物运动不能。本实验利用氟哌啶醇致僵直大鼠模拟帕金森病的运动不能，通过高频电刺激下丘脑后核〔PH〕，观察大鼠僵直和运动能力的变化，探索 PH 在帕金森病中的作用，从而探讨PH 在 DBS 治疗 PD 的中潜在的应用价值，拓宽现有的 DBS 刺激靶点，为临床应用提供实验依据。

1、材料和方法

1.1 实验动物

健康成年 Sprague-Dawley〔SD〕雄性大鼠 24 只购于第四军医大学实验动物中心，体重 280 g±20 g。安静环境饲养，室温 22±1 ℃，人工昼夜节律〔12 h/12 h〕，自由取食饮水。

1.2 实验分组及给药途径

将大鼠完全随机分为 3 组，每组 8 只，即对照组〔给予等体积生理盐水〕，假刺激组〔给予 1 mg/kg 氟哌啶

醇,PH 置入电极不刺激〕，刺激组〔给予 1 mg/kg 氟哌啶醇，PH 130 Hz，波宽 60μs，强度 100 μA 的高频电刺激〕。每组按大鼠每公斤体重 2 mL腹腔注射给予生理盐水或氟哌啶醇。

1.3 主要试剂与仪器

氟哌啶醇〔美国 Sigma〕，克紫〔美国 Sigma〕，氨苄青霉素〔哈药集团〕，水合氯醛〔上海山浦化工〕，玻璃离子体水门汀〔上海青浦尼康齿科器械厂〕，立体定向仪〔深圳瑞沃德 68025〕，微型电动颅钻〔深圳瑞沃德〕，跑步机〔美国

Panlab LE8706〕，双极刺激电极〔美国 Rhodes SNEX-100〕，刺激器〔日本 Nihon Kohd-en SEN-3301〕，冰冻切片机〔德国 Leica CM1950〕。

1.4 PH 电极置入

用 7 %水合氯醛成功麻醉大鼠后，以俯卧位将头部定于立体定向仪上，常规去毛发、消毒，切开头皮约 10 mm,剥离皮下组织及骨膜，常规止血，用双氧水清理颅骨外表，清晰暴露前后囟，调整大鼠门齿固定器使前后囟在同一水平面上，参照 Paxi-nos 等大鼠脑立体定位图谱，确定双侧 PH 位置(AP：-3.8 mm，ML:±0.2 mm, DV:-7.6 mm)。用微型电动颅钻钻透颅骨，以注射器针头轻轻将硬脑膜扎破，双侧置入双极刺激电极，其周围置入不锈钢螺丝 4 个，用牙科水泥固定。术后给予肌肉注射青霉素〔10 万 U/kg, 2 次

/d〕3d 抗感染，单笼饲养，恢复一周。

1.5 行为学检测

大鼠腹腔给予氟哌啶醇〔1 mg/kg〕30 min 后，分别利用爬杆试验〔bar test〕和跑步机试验〔treadmill test〕评价大鼠的僵直程度和运动能力。爬杆试验：垂直地将大鼠

前肢置于一根离实验台 10 cm、水平放置的金属杆上，后肢置于实验台上，记录大鼠保持垂直体位、至少有一前肢在杆上的时间〔潜伏期 latency〕。

潜伏期大于 15 s 认定为僵直，最长潜伏期设定为 180 s。跑步机试验：跑道坡度为 0，电击电流为 0.4 mA,跑步程序为从跑步机最小速度 5 cm/s 开始，依次调速至 10, 15, 20, 30, 50, 70 cm/s，每档速度持续时间为 2 min，随后休息 2 min，直到大鼠累积电击时间超过 30 s,停止试验，比拟组间大鼠平均速度和总跑动路程。

1.6 电极位置组织学定位

行为学检测完毕后，大鼠经水合氯醛深度麻醉，通过双侧PH 刺激电极给予直流电〔0.2 mA,10 s〕标记刺激电极尖端位置。常规灌流、固定、脱水，行连续冠状冰冻切片〔20 μm〕，用临时配制地 0.01 %克紫进行尼氏染色〔Nissl’s staining〕，光镜下观察，凡电极尖端不在下丘脑后核范围内的不纳入后续统计分析。

1.7 统计方法

用 SPSS 17.0 统计软件进行比拟分析，潜伏期、平均速度、总跑动距离以 X±S 表示。组间差异采用单因素方差分析，P﹤0.05 为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 电极位置组织学定位

如图 1 所示，对照大鼠脑立体定向图谱可知刺激电极尖端位于 PH 范围内，电极周围可见胶质细胞浸染呈深染。

2.2 PH 刺激对大鼠僵直的影响

对照组大鼠均在 5 s 内爬下金属杆，平均潜伏期为〔2.63±1.3〕s，无僵直。假刺激组和刺激组均产生僵直，其潜伏期分别为〔167.88±17.88〕、〔77.5±21.27〕s。3 组间比拟差异具有统计学意义〔F=212.36，n=8,P=0.000〕，刺激组潜伏期显著短于假刺激组〔P=0.000〕，仍然长于正常对照组〔P=0.000〕，提示 PH 高频电刺激可局部逆转氟哌啶醇致僵直作用(见图 2)。

2.3 PH 刺激对大鼠运动能力的影响。

对照组大鼠最大跑动速度可达 70 cm/s，平均跑动速度为(24.55±2.89)cm/s，假刺激组和刺激组平均跑动速度分别为〔5.78±0.90〕和〔12.72±3.66〕cm/s，3 组间比拟差异具有统计学意义〔F=95.75，n=8,P=0.000〕。与假刺激组比拟，刺激组平均速度显著提高〔P=0.000〕，但仍然低于正常对照组〔P=0.000〕(见图 3)。相应地，对照组大鼠跑动路程为〔189.51±34.17〕m，假刺激组和刺激组跑动路程分别为〔8.06±4.35〕m 和〔98.61±96.75〕m，3 组间比拟差异具有统计学意义〔F=18.73，n=8,P=0.000〕。与假刺激组比拟，刺激组跑动路程显著提高〔P=0.006〕，但仍然低于正常对照组〔P=0.006〕〔见图 4〕。以上说明大鼠腹腔注射氟哌啶醇后运动能力显著下降，给予 PH 核高频电刺激可局部逆转氟哌啶醇的作用。

3、讨论

脑深部刺激〔DBS〕自应用于帕金森病治疗以来，因其非破坏性、可逆性，确切的疗效，较少的副作用和并发症，越来越受到人们的认可，被认为是目前治疗帕金森病的最正确方法。根据患者主要病症的不同选择相应的靶点，如丘脑底核〔subthala-mic nucleus, STN〕，苍白球内侧部