慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

、包装细胞293T 细胞的培养

一、293T 细胞的冻存

1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T 细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

5

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3 X10个/ml。

4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。

三、293T 细胞的复苏

1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。

5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下

5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Uni versal PCR Master Mix (Applied Biosystems , cat. no.

4304437)

3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems 401970)

用于包装的293T 细胞的培养

用于包装的293T 细胞(ATCC No. CRL-11268) 必需选择处于生长旺盛期，细胞状态

较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达 到

100%。 慢病毒的包装

1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X 10 6个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为

30-40% ，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的Opti-MEM 培养

基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G 质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml 。另一支中加入 500卩l Trans -EZ 溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。

将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，

边加边轻轻晃匀。

cat. no. 4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems

cat. no. 4316844)

SunBio IV Victor

*

+

M VJ Ira ：sJuUion

Packaging Cel]

关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。 6. 室温孵育20分钟，使DNA 和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。

7. 取1支5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml 。来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。 8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的DMEM 完全培养基。 9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 。如果所

转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于

95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合 形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。

12.4 C, 500g 离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13.总的上清约为204 ml ，用250- ml 0.45 卩m PVD 过滤装置过滤。如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化 方法一超速离心沉淀法

离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫 2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。

1.取 6 个 Ultra-clear SW28 外灯继续消毒30分钟。

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