研究生课程-基因工程考试复习题集

名词解释

1、基因组

基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。

2、星号活性

在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。

3、退火

是指在温度降低时，DNA发生复性的过程，即变性后的两条单链以碱基互补为原则配对形成氢键，结合成双链。

4、BLAST

BLAST是“基本局域联配搜索工具”( Basic Local Alignment Search Tool)的字头缩写, 是最常用的比较核酸和蛋白质同源性的比较工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。

5、α-互补

有的质粒载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lac Z)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。其相应宿主细胞带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和宿主细胞编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但它们融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种现象叫α-互补。简言之，A -互补是指E. coli β-半乳糖苷酶的两个无活性片段( N端片段和C端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。

这种lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。

6、同工酶

生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶

同裂酶：指来源不同但识别相同的核苷酸靶系列，切割位点相同，切割后形成相同的粘性末端的限制性内切酶。

同尾酶：来源不同，识别的靶系列也各不相同，但切割后产生相同的粘性末端的限制酶。7、质粒

质粒(Plasmid) 是细菌菌体内的一种环状DN A分子，是一种染色体外的稳定遗传因子，它可以独立于细菌的染色体DNA 而复制。

8、基因工程

在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖。

基因工程：又叫基因操作或重组DNA技术，在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。或：克隆编码特定性状的基因，通过生物、物理和化学等方法，导入到受体生物细胞，然后通过组织培养培育出转基因个体的整个过程。

9、克隆

Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

Clone(动词)：产生一个遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体的过程。

10、DNA克隆

将某一特定DN A片段通过重组DN A技术插入到一个载体( 如质粒和病毒等)中, 然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。

简答题

1、TA克隆原理及影响因素。

TA克隆原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?

1. 纯化PCR产物。切胶回收的PCR片段最好

2. 除去残存的引物等杂质。

3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA 的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。

PCR产物难以插入载体，为什么?

1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长, 长时间保存的PCR 产物会脱去末端的"A"碱基。

2. PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

3. 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

4. 确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。

5. 确认抗生素的浓度是否过大。

6. 最好使用新配制的平板培养基（T载体技术是比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用，该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，既能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。）

2、PCR的原理及基本过程。

原理：原理类似于DNA的天然复制过程。人工合成与待扩增的DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可将目的DNA扩增上百万倍。3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增10 6-10 9倍。

过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

PCR模拟DNA的天然复制过程，在试管内创造合适的条件，以给定的DNA为模板，以恰当的寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核糖核苷酸为底物，由DNA聚合酶催化特定DNA链进行合成（扩增）。

①变性(denaturation)是指通过加热使DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA的过程。通常加热到92～95℃可使一切复杂的DNA发生变性。

②退火(annealling)是指在温度降低时，DNA发生复性的过程，即变性后的两条单链以碱基互补为原则配对形成氢键，结合成双链。

③延伸(extention)是指从引物的3’端开始，沿DNA模板，按碱基配对与半保留复制原理，由DNA聚合酶催化合成一条新的与模板DNA链互补的复制链

3、Southern印记杂交的基本原理及应用。