小鼠胚胎体外培养研究
小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究
ｃ ｔｃ ｍｉｔ ． ＰＥＧ Ｆ ｙｏ ｈｅ ｓｒ ｙ Ｐ ｗｅ ｅ ｒ ｎｓｅ ｒ ｄ ｎ ｏ ｒ ｔａ ｆｆｅ ｉｔ ＮＳ ｂ Ｎｕｃｅ ｆｃ ｏＴＭ ． Ａｆｅ ｓ ｌｃｅ ｂ Ｇ４１ ｔ ｅ ｏｏ ｅ ｗｉｈ ｈ Ｃｓ ｙ ｌ ｏｅ ｔ ｒ ｔ ｒ ｅｅ ｔｄ ｙ ８．ｈ ｃ ｌｎｉｓ ｔ ｔ ｅ ｂ ｓ ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｆ ＥＧＦＰ ｒ ｏ ｅ ｖ ｄ ｎ ｓ ｌｃ ｅ ｕ ｉｇ ｌｕ ｒ ｓ ｅｎ ｅ ｅ ｔ ｘ ｅ ｓｏ ｏ ｗｅ ｅ ｂｓ ｒ ｅ ａ ｄ ｅｅ ｔ ｄ ｓｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｃ ｍｉ ｏｓ ｏ ｅ ａ ｄ ｄ ｎ ｉｅ ｗ ｔ ｍｍｕ ｏ ｙ ｏ ｃｒ ｃ ｐ ｎ ｉｅ ｔ ｄ ｉ ｉ ｉ ｆ ｈ ｎ ｃ ｔ—
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基础 研 究 ・
小 鼠胚胎 神经干细 胞的体外培养及增强型绿色荧光 蛋 白基 因转 染研 究
武 强 李 露 斯 范 文 辉 杨 忠
摘 要 目 的 ： 索 小 鼠胚 胎 神 经 干细 胞 （ ｅ ｒｌ ｓ ｍ ｃ ｌ ， Ｓ ｓ 的体 外 培 养 ， 讨 Ｎ Ｃ 作 为 基 靶 细 胞 ， 及增 强 探 ｎ ｕａ ｔ ｅｌ Ｎ Ｃ ） ｅ ｓ 探 Ｓｓ 以
ｏ Ｎ Ｃ ｅ ｇ ｇ ｎ ａｇ ｔｃ ｌ ｎ ｎ ａ ｃ ｄ ｇｅ ｎ ｆ ｏｅｃ ｎ ｒｔｉ （Ｇ Ｐ ａ ｅ ｎ Ｓ ｓ ｔ ｏ Ｔ ｅ Ｎ Ｃ ｆ Ｓ ｓ ｂ ｉ ｅ ｅ ｔｒｅ ｅｌ ａ ｄ ｅ ｈ ｎ ｅ ｒｅ ｕ ｒｓｅ ｔｐ ｏ ｎ Ｅ Ｆ ）ｌ ｌ ｇ Ｎ Ｃ ． ｈ ｄ： ｈ Ｓ ｓ ｎ ｓ ｌ ｅ ｂ ｉ Ｍｅ
维普资讯
巾图康复医学杂志，０６ 第 ２ 卷， １ 期 Ｃ ｉ ｓ Ｊ ｒａｏ ｅａｉ ａｏ ｅｉｎ ９ Ｉ 鱼 ！ ， ！ ２０ 年， １ 第 ｏ ｈ ｅｅ ｏ ｎｌｆＲｈｂｉｔｎＭ ｄｃ １ ｎ ｕ ｌ ｉ ｔ ｉ ＿ ． ！ ： ： ！
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学学生姓名学生学号指导教师XXXX年XX月XX日小鼠早期胚胎发育的研究一、引言胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
小鼠卵细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠卵细胞的采集、培养和成熟方法。
2. 观察卵细胞在培养过程中的形态变化和成熟程度。
3. 为后续胚胎发育实验提供成熟的卵细胞。
二、实验原理小鼠卵细胞培养成熟是胚胎发育研究的基础，通过体外培养和成熟，可以观察到卵细胞从生发泡到成熟卵细胞的全过程。
本实验采用小鼠卵巢组织，通过体外培养，使卵细胞在适宜的培养条件下完成成熟过程。
三、实验材料1. 小鼠卵巢组织：雌性小鼠，体重20-25g。
2. 培养基：卵细胞培养液（CO2饱和）。
3. 仪器设备：超净工作台、显微镜、解剖显微镜、培养皿、移液器、剪刀、镊子等。
四、实验步骤1. 采集小鼠卵巢组织：将雌性小鼠麻醉后，剖腹取出卵巢组织。
2. 处理卵巢组织：将卵巢组织置于超净工作台，用剪刀剪成小块，放入培养皿中。
3. 卵细胞采集：用镊子轻轻挑取生发泡，将其置于培养皿中。
4. 卵细胞培养：将采集到的卵细胞放入CO2饱和的培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
5. 观察卵细胞成熟：每隔24小时观察卵细胞形态变化，记录成熟程度。
6. 取成熟卵细胞：当卵细胞达到成熟程度时，用移液器将卵细胞收集到另一培养皿中。
7. 实验结束：将收集到的成熟卵细胞进行后续实验或保存。
五、实验结果1. 卵细胞采集：成功采集到生发泡，其中含有一定数量的初级卵母细胞。
2. 卵细胞培养：在培养过程中，观察到卵细胞逐渐从生发泡状态发育为成熟卵细胞。
3. 卵细胞成熟：经过48小时的培养，大部分卵细胞达到成熟程度，出现第一极体。
六、实验分析1. 本实验成功采集到小鼠卵巢组织中的初级卵母细胞，为后续实验提供了充足的卵细胞资源。
2. 在卵细胞培养过程中，观察到卵细胞逐渐成熟，说明本实验所采用的方法对卵细胞成熟具有促进作用。
3. 实验结果表明，小鼠卵细胞在体外培养条件下可以成熟，为胚胎发育研究提供了技术支持。
七、实验总结1. 本实验成功实现了小鼠卵细胞的采集、培养和成熟，为后续胚胎发育实验奠定了基础。
小鼠胚胎获得实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠胚胎的采集方法。
2. 了解小鼠胚胎的发育过程。
3. 培养实验操作技能。
二、实验原理小鼠胚胎的获得是通过人工操作，将雌鼠的受精卵取出，进行体外培养，直至发育成胚胎。
该实验旨在研究小鼠胚胎的发育过程，为后续的胚胎移植、基因编辑等研究提供基础。
三、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠、雄性小鼠2. 实验仪器：显微镜、解剖显微镜、培养箱、离心机、培养皿、手术器械等3. 实验试剂：生理盐水、DEPC水、培养液、抗凝剂、消毒剂等四、实验步骤1. 实验动物处理（1）将雌性小鼠和雄性小鼠分别饲养于清洁、通风的动物房中，保持适宜的饲养条件。
（2）雌性小鼠和雄性小鼠分别进行交配，交配后观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
2. 胚胎采集（1）雌性小鼠交配后第2天，用解剖显微镜观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
（2）雌性小鼠交配后第3天，将雌性小鼠麻醉，固定于解剖显微镜下。
（3）用手术器械取出雌性小鼠的子宫，置于培养皿中。
（4）在解剖显微镜下，用镊子取出受精卵，置于培养皿中。
3. 胚胎培养（1）将受精卵放入培养箱中，在37℃、5%CO2、95%空气的条件下培养。
（2）观察受精卵的发育过程，记录胚胎的形态变化。
4. 实验结果分析（1）观察胚胎的发育过程，记录胚胎的形态变化。
（2）分析胚胎发育过程中各阶段的形态特征。
五、实验结果1. 胚胎发育过程（1）受精卵在培养箱中培养24小时后，可见胚胎开始分裂。
（2）培养24小时后，胚胎发育至桑椹胚阶段。
（3）培养48小时后，胚胎发育至囊胚阶段。
（4）培养72小时后，胚胎发育至原肠胚阶段。
2. 胚胎形态特征（1）受精卵：透明、圆形，直径约100μm。
（2）桑椹胚：细胞数目增多，排列紧密，形成桑椹状。
（3）囊胚：细胞分化明显，形成囊胚腔。
（4）原肠胚：细胞分化更加明显，形成原肠。
六、实验结论1. 通过人工操作，成功获得小鼠胚胎。
2. 小鼠胚胎在体外培养过程中，经历了受精卵、桑椹胚、囊胚、原肠胚等阶段。
小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学学生姓名学生学号指导教师XXXX年XX月XX日小鼠早期胚胎发育的研究一、引言胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
小鼠的体外实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外培养小鼠细胞，观察细胞在不同条件下的生长情况，分析细胞增殖、分化及凋亡等相关生物学行为，为进一步研究小鼠细胞生物学特性提供实验依据。
二、实验材料1. 小鼠胚胎成纤维细胞（CRL-1658）；2. DMEM培养基（高糖）；3. 胎牛血清；4. 0.25%胰蛋白酶；5. PBS缓冲液；6. CO2培养箱；7. 倒置显微镜；8. 流式细胞仪；9. 试剂盒及相关仪器。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于6孔板，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
2. 细胞传代：当细胞贴壁生长至约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:3比例传代。
3. 实验分组：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予不同浓度的实验药物处理，对照组给予等体积的溶剂处理。
4. 细胞形态观察：利用倒置显微镜观察细胞在不同处理条件下的形态变化。
5. 细胞增殖检测：采用CCK-8法检测细胞增殖情况，每组设3个复孔。
6. 细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，每组设3个复孔。
7. 细胞周期分析：采用PI染色法检测细胞周期分布，每组设3个复孔。
8. 流式细胞仪检测：对细胞进行流式细胞仪检测，分析细胞增殖、凋亡及周期分布情况。
四、实验结果1. 细胞形态观察：实验组细胞在给予不同浓度实验药物处理后，细胞形态发生明显变化，与对照组相比，细胞生长速度减慢，细胞皱缩、变圆，部分细胞出现凋亡现象。
2. 细胞增殖检测：CCK-8法结果显示，实验组细胞增殖明显低于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞增殖抑制作用增强。
3. 细胞凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，实验组细胞凋亡率明显高于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞凋亡率升高。
4. 细胞周期分析：PI染色法结果显示，实验组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例降低，G2/M 期细胞比例升高，说明实验药物处理可抑制细胞增殖，促进细胞周期阻滞。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
激素对小鼠胚胎体外发育的影响
激素对小鼠胚胎体外发育的影响摘要探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。
取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。
试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。
由此可认为,高浓度的PMSG和HCG 对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。
关键词激素;小鼠胚胎;体外发育;影响EffectsofHormoneonDevelopmentofMousePreimplantationEmbryosinVitroYAO YingXU Ying *CHEN Yi-fei(College of Medicine,Jiaxing University,Jiaxing Zhejiang 314001)AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.Key wordshormone;mouse preimplantation embryos;development in vitro;effects早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用[1]。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究
江丙农业学报2010，22(12)：144～146A c t a A g r i c uhu r ae J i an gxi小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究林峰，陈玉霞+，孙克宁，杨婷，田晓军(河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002)摘要：为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响，分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。
结果表明：子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0．01)，而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P< O．05)，两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P>0．05)，说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著，且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。
小鼠早期胚胎发育观察结果表明：超排处理后，在公母鼠合笼后76～79．5h采胚，胚胎大多处于桑椹胚期，而在公母鼠合笼后88～91．5h采胚，胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期；采用TC M l99+15％胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。
关键词：小鼠；超数排卵；早期胚胎；体外培养；冲胚方法中图分类号：Q132．8文献标识码：A文章编号：1001—8581(2010)12—0144—03St udy on E f f ect of Super ovul a t i on and i n vi t r o C ul t ur e of Ear l y Em br yo i n M ous eLI N Fe n g，C H E N Y u—xi a‘，SU N K e—ni ng，Y A N G Ti ng．T I A N X i ao—j u“(C ol l ege of A n i m a l H us ba ndr y a nd V et er i nar y M e di ci ne，H enan A矛c ul t ur al U ni ver si t y．Z he ngzhou450002，C hi na)A bs t r act：I n t hi s paper．t he e ffe c t of dif f erent m e t h ods of c o l l ec t i n g e m br yos on t he s uper ovul at i on of m i c e w a s s t udi ed，and t he e m br yos i n t he suoer ovul at ed m i Ce w er e coll ected by usi ng t he ut erus—m i nc i ng m e t ho d a nd ut er us—col l ect i ng m e t hod re s pec t i ve l y．ne r es ult s show e d t ha t t he aver age num ber of eggs and em bryos obt ai ned by t he ut er us—co l l ect i ng m e t ho d w er e,ext r em el y s ignif i ca ntl y hi gher(P<0．01)t han t hos e obt ai ned by t he ut e r us—m i nci ng m e t hod，an d t he aver age nu m ber of us abl e em bryos obt ai ned by t he u t e r r us—coll ect i ng m e t he d w强si gni f i cant l y hi gher(P<0．05)t han t ha t di d by t he ut erus—m i nc i ng m et hod．ne aver age num be r of an-fe r t i l i zed eggs obt ai ned by t hes e t w o m e t h ods w a s no t s ignif i cant ly di f f er e nt(P>O．05)．So t he s uper ovu l at i on e ffe c t of m i c e W a S s i g-nif i e ant lv i nnue nee d by t he m e t ho d of coll ect ing em bryos．T he obs er vat i on r es ult s of ear l y e m br yos de vel opm ent i ndi cat ed t hat m ost of t he em bryos coll ected76—79．5hour s aft er com bi ni ng cages w e r e at m or ul a s t age．w hi l e m os t of t}l e em bryos coll ected88～91．5 hour s a ft e r com bi ni ng cages w e r e a t com pa ct e d m or u l a s t a ge and bla s t o e yst s t ag e．I t W a S f eas i ble t ha t t he em bryos of m i c e w er e cul t i—vat ed i n vi t ro by usi n g t he m i xed s o l ut i o n of T C M l99and15％F C S．K e y w or ds：M ouse；Sup er ov ul at i on；E ar l y em br yo；I n vi t ro cul t ur e；M e t hod of coll ect ing em bryos雌性哺乳动物一生所产的卵子总数早在其胚胎发育形成卵巢的过程中已被确定，成熟卵子在成年后的发情周期中分别排出，但是单纯依靠动物的自然排卵，一方面所得到的卵母细胞数或胚胎数较少，另一方面又消耗大量的时间和浪费较多的动物．因此为了获取大最的胚胎，多采用超数排卵的方法，即利用外源性促性腺激素诱发多个卵泡同时发育并排出具有正常受精能力的卵子¨。
胚胎培养实验报告
一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。
2. 观察胚胎在体外培养过程中的发育变化。
3. 学习胚胎培养技术在生殖医学和生物研究中的应用。
二、实验原理胚胎培养是利用人工手段，在适宜的条件下，模拟胚胎在母体内的发育环境，使胚胎在体外继续发育。
胚胎培养技术广泛应用于生殖医学、生物研究等领域。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：小鼠胚胎、培养皿、移液枪、显微镜等。
2. 试剂：胎牛血清、DMEM培养液、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等。
四、实验方法1. 胚胎收集：将小鼠处死，取其输卵管，收集胚胎。
2. 胚胎消化：用胰蛋白酶消化胚胎，制成细胞悬液。
3. 胚胎计数：用移液枪吸取细胞悬液，滴加到计数板上，计数胚胎数量。
4. 胚胎培养：将胚胎细胞悬液接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 观察记录：每天观察胚胎发育情况，记录胚胎数量、形态变化等。
五、实验结果1. 胚胎发育过程：- 第1天：胚胎数量较少，细胞排列紧密。
- 第2天：胚胎数量增多，细胞排列开始松散。
- 第3天：胚胎数量继续增多，细胞排列更加松散，出现囊胚形态。
- 第4天：胚胎数量继续增多，囊胚形态明显，出现桑椹胚。
- 第5天：胚胎数量继续增多，桑椹胚形态明显，出现早期囊胚。
- 第6天：胚胎数量继续增多，早期囊胚形态明显，出现晚期囊胚。
2. 胚胎形态变化：- 胚胎细胞在体外培养过程中，形态逐渐发生变化，从单个细胞逐渐发育成囊胚、桑椹胚等。
六、实验讨论1. 胚胎培养技术是生殖医学和生物研究的重要手段，在人类辅助生殖、动物繁殖等方面具有广泛应用。
2. 胚胎培养过程中，影响胚胎发育的因素较多，如培养条件、细胞密度、培养基成分等。
3. 通过本实验，我们掌握了胚胎培养的基本原理和操作步骤，观察了胚胎在体外培养过程中的发育变化。
七、实验结论1. 本实验成功培养了小鼠胚胎，观察了胚胎在体外培养过程中的发育变化。
2. 胚胎培养技术在生殖医学和生物研究等领域具有广泛应用前景。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
小鼠胚胎培养方法的探究
小鼠胚胎培养方法的研究摘要目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。
方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。
每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵山西医科大掌裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。
结果：一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。
而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。
两组比较有显著性差异。
２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。
与对照组比较有差显著性异。
３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。
与对照组无显著性差异。
二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。
鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。
三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组中的调亡速度明显低于对照组，有显著性差异，而血清组中鼠胚的调亡速度低于对照组，但无显著性差异。
小鼠4、8-细胞胚胎单卵裂球体外培养体系的研究
单个卵裂球的分离和培养是一种相对简单 而有效 的获得遗传 同质动物的方法 。Ｎｃｏ ｓ 【 次对大 鼠 ｉ ｌ 等１ ｈａ 首
１ ４ ８ 细胞胚胎 的收集 ． 、一 １
选择 ６ ８ ～ 周龄 昆明 白系雌
性小 鼠（ 中国军事医学科学院， 洁级） 清 ， 每只隔 日腹腔注 射Ｐ Ｓ（ Ｍ Ｇ 宁波市激素制 品厂） ｈ Ｇ 宁波市 激 素制 品 和 Ｃ（
厂） １ 各 ０ ｕ进行超排 处理后与成年公鼠交配 。 日晨检 Ｉ 次 查 阴道栓 ， 有栓雌 鼠于 ｈ Ｇ注处死 ，取出输卵管并在实体显微镜下撕破 ， 以获取 ４ ８ 细胞胚胎 。收集形态正常的 ４ ８ 细胞 或 一 或 一 胚胎供试验用 。 操作在室温 ２ ℃和 ３ ￣恒温 台上进行 。 ５ ７（ ２ １ 卵 裂球分离培 养 以下操 作 均在 ３ ℃恒 温 台上 ． ２ ７ 进 行 。将 ４ 细 胞 胚 胎 在 含 ０５ ｗｖ 一 ． ％（／ ）链 酶 蛋 白酶 （Ｒ Ｎ Ｓ ） ｃ Ｍ 的 ｍ Ｂ Ｐ Ｏ Ａ Ｅ无 ａ 、 Ｐ Ｓ中处 理 ２ ３ｍ ｎ 再 于 ～ ｉ， 无 Ｃ ２、 ｇ 的 ｍ Ｂ ａ Ｍ２ Ｐ Ｓ溶液 中 以吸管 吹 打成 单个 卵裂 球 。８ 细胞胚胎分离前 先在无 Ｃ ２ Ｍ ２ ｍ Ｂ 溶液 一 ａ、 ｇ 的 Ｐ Ｓ ￣
胞共培养， 囊胚发育率分别为 ４ ％和 ２ ％， 其 ７ ６ 囊胚细胞数分别为（７ ７ ． ） １ ． ±０ ２， 高于单一培养（ １． ±１ ３和（１ ３ ． ） ５ １ ４ ９ 均 尸＜００） ． 。 ５ 关键词 ： 畜牧、 医科学基础学科 ； 兽 卵裂球 ； 体外培养 ； 输卵管上 皮细胞 ； 猪 小鼠
小鼠发育生物学实验内容
小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。
二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。
2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。
精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。
未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。
5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。
实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。
二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。
小鼠实验胚胎技术
整理版ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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LIM1基因敲除无脑小鼠
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震颤小鼠与多发性硬化
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震颤小鼠与多发性硬化
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转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理
克隆目的基因 构建载体
精子 载体法
雄原核 注射法
胚胎 感染法
• 缺点：相对复杂
存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大
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曲细精管注射法：
将外源基因注射入雄性动物的曲细精 管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随 机整合入受体基因组，再通过精卵受精产 生带有外源基因的个体。
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曲细精管注射法流程图
目的基因克隆、纯化
逆转录病毒载体的构建
雄性个体曲细精管注射
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嵌合体动物制作方法：
一、聚合法 1. 胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚
胎去透明带后，在植物血凝素的作用下， 互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎， 移植后发育成一个个体。
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2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹 期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝 素的作用下，形成一个融合胚胎，移植 后发育成一个个体。
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胚胎干细胞法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入
• 缺点：环节多、过程复杂
需要昂贵仪器
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细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
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小鼠胚胎体外培养研究
【摘要】本文所选用的实验材料为小鼠原核胚，主要研究几种不同溶液、溶液所含不同生长因素、不同培养气象等所对小鼠原核胚发展产生的影响，主要目的是最终找到一种适于小鼠胚胎成长的培养环境以及溶液成分，进而不断优化小鼠胚胎体外培养的体系结构。
并且为其它哺乳类动物的胚胎体外培养提供一些参考。
【关键词】小鼠；胚胎；体外培养
0.前言
在迈入新世纪以后，我国的科学技术发展十分迅猛，尤其是我国的生物科技得到了广泛的推广与使用，从而加快了人类社会的发展。
胚胎工程是指主要针对胚胎哺乳类动物的胚胎所进行的工程技术操作，之后再将胚胎继续发育，从而使人们获得所需的成体动物的一种全新技术。
当前，胚胎工程在蓄牧种繁殖预遗传资源保护、利用方面得到了广泛推广和使用，并且在人类疾病真毒、药物研发等研究方面蕴含巨大应用价值，因此，受到人们高度的关注。
1.材料预方法
1.1实验所需的材料
实验所需的动物：清洁过的雌性预雄性小鼠，所选用的雌性小鼠年龄约在28—35日的日龄范围内，共约250只，而选用的雄性小鼠日龄在56天以上，共有32只。
选用的实际预药品主要有，丙酮酸钠、青霉素钠、链霉素、探索氢钠、氯化镁、牛磺酸等。
而所选用的仪器主要有倒置显微镜与实体显微镜，离心机、PH仪、显微图像管理系统等。
小鼠胚胎培养液主要有三种，即HTF、CZB、KSOM 溶液。
在配制每一种溶液时都要进行过滤，以便除菌，并且还要放在4摄氏度的环境下进行保存。
1.2小鼠超数排卵
从中选用体重超过25g雌性小鼠，要在小鼠腹腔中注射PMSG20IU，待48小时之后再在腹腔中注射Hcg10IU。
雄性小鼠要选用体重超过30g的，严格按照雌性鼠预雄性鼠比例为2：1的比例放在同一个笼中混合养殖，在第二天早晨要检查小鼠的阴道栓，将具有阴道栓的雌性小鼠在20—23小时范围内提取卵母细胞预卵丘细胞的复合体。
1.3采集小鼠的原核胚
在注射hCG后的22小时后，采用颈椎脱臼方法将小鼠处死，在用酒精消毒之后，剪开腹腔，在沿着小鼠卵巢端剪取输卵管，将输卵管放在生理盐水的35mm 培养器皿中，然后将培养器皿放进实验室，将小鼠的输卵管放入到洗卵液培养器皿中浸泡一段时间。
与此同时，要求实验人员在体视显微镜下准确找到输卵管膨大位置，再使用专门的注射器将其划破，然后轻轻挤压小鼠输卵管端部，从而大量溢出小鼠卵母细胞复合体。
1.4培养小鼠原核胚
首先，要制作一胚胎培养碟，然后将小鼠原核胚放入其中，并且在上部覆盖一层石蜡油，将其放置在碳培养箱中，调节至37度环境下预热四个小时。
把细胞复合体取出放在500uLHTF溶液中，利用移液枪吹打几次，并将脱光卵丘细胞原核胚抽取出。
多次反复进行此操作，待卵细胞全部脱落后，再将其移动到胚胎培养碟中培养。
在移入时标记为0小时，在24小时以后，便开始观察小鼠卵细
胞的分裂情况，而在48小时之后便开始观察小鼠细胞分裂情况，在72小时后观察小鼠桑椹胚分裂，在96小时后观察小鼠囊胚分裂轻，而在120小时之后，便开始观察小鼠囊胚孵化情况。
1.5实验设计方案
实验1不同培养基培养小鼠原核胚体，将正常受精之后的小鼠原核胚分为3小组，并且分别放入到三种不同培养基中，即HTF、CZB、KSOM中，共培养约120小时。
并且要不断观察小鼠原核胚发育状况，对三组胚胎发育率加以统计，此次实验要进行多次。
实验2置于不同浓度的EGF或者是bFGF的KSOM溶液培养小鼠原核胚体将受精后的正常原核胚分成7组，分别在含有EGF以及bFGF的KOSM溶液中培养120小时。
并且要不断观察小鼠的原核胚发育状况，再将各组培养基中小鼠胚胎发育率加以统计。
此实验重复进行几次。
实验3利用WOW法培养小鼠原核胚，在受精后的原核胚分成2组，利用WOW法以及成组培养法培养小鼠原核胚胎。
在培养约120小时左右，观察其原核胚发育情况，统计各组胚胎发育率，此实验重复进行多次。
实验4将小鼠原核胚体放在不同培养气相中培养，将受精后的原核胚分成3组，分别放在不同的混合气体中培养约120小时。
观察小鼠原核胚体发育状况，统计各组胚胎发育率。
此实验重复进行多次。
2.结果分析
2.1三组溶液对小鼠原核胚体发育产生的影响
通过实验我们得出：在这三组溶液中，其卵裂率、囊胚率、囊胚细胞并没有较大差异。
其中，在KOMS溶液中的卵裂率是最大的，而CZB溶液中囊胚率比其它两种溶液要高，然而，HTF囊胚细胞数是最多的。
2.2 KSOM中EGF或者bFGF含量不同对小鼠原核胚体发育产生的影响
在培养基中，加入不同溶度的EGF或者是BFGF，并不会对小鼠原核胚发育产生较大的影响。
2.3 WOW对小鼠原核胚体发生产生的影响
实验结果表明：从卵裂率方面来分析，WOW要高于对照组，但是，效果不是十分明显；从小鼠受精细胞的囊胚率、囊细胞数角度分析，利用WOW法分裂能力要明显高于对照组。
因此，便得出培养小鼠原核胚应该最好利用WOW法，其培养效果较好。
2.4培育气相不同对小鼠原核胚胎发育产生的影响
通过实验证明，在氧气浓度为5%的KSOM培养液与在肺气组CZB溶液中的的培养效果最好。
3.讨论
3.1不同溶液对小鼠原核胚体发育影响
对于哺乳类动物胚体的发育来说，是受很多因素影响的，但是，最主要的影响因素是培养基。
然而，当前，哺乳类动物胚体体外发育往往会选用集中溶液包含HTF、CZB、KSOM等。
虽然其它类型的胚胎培养液也可以支持哺乳动物胚胎的体外发育。
然而，在体外培育胚胎过程中，常表现出一定程度的发育阻滞。
在通过大量实验证明，HTF培养效果最好。
3.2不同浓度EGF或者是BFGF对小鼠胚体发育带来的影响
通过实验证明，小鼠的早期胚胎在体外发育过程中，因小鼠胚体原性生长因素在胚体发育中有较强的分泌调控能力，能够快速使胚体发育至囊胚时期。
然而，
只依靠内源性生长因素，会导致胚胎发育非常缓慢，并且囊胚的发育率偏低，最终导致囊胚细胞较少。
因此，胚胎发育需要来自怒踢生殖管道分泌的生长因子的共同参与。
但是，如果不具有外源性生长因素，那么会严重阻碍小鼠胚胎发育。
3.3培养方法不同对小鼠胚体发育产生的影响
在体外培养胚胎时，采用微滴方式可以促进胚胎的发育，但是，在选用WOW 法培养胚胎时，因胚胎间相互隔离，能够使胚胎分泌的因子不被稀释，通过自分泌的方式作用在胚胎上，与此同时，又可以阻碍有毒物质作用在胚胎上，阻碍其发育率。
3.4培养气相不同对小鼠胚体发育产生的影响
通过上述实验证明，在氧气浓度为5%的条件下，KOSM培养溶液效果要高度其它几组，但是，其它两组培养效果没有较大差异。
虽然小鼠胚体能够在高浓度的氧气环境中生长预发育，然而，在低浓度氧气环境下，能够提高胚胎的存活率，更会促进胚胎的发育。
【参考文献】
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